 |
2.2.5. Референтные сыворотки. 2.2.6. Опытные сыворотки. 2.2.7. Добавление клеток. 2.2.8. Фиксация в ацетоне и окрашивание с использованием реакции иммунофлуоресценции
|
|
|
|
2. 2. 5. Референтные сыворотки
В каждый тест следует включать национальный или международный референтный сывороточный стандарт, разведённый до иммуногенности 2, 0 МЕ/мл. Референтная сыворотка, используемая в Центрах по борьбе и профилактике болезней, является вторым международным стандартом для иммуноглобулина бешенства (Lyng, 1994), который можно получить из Национального института по биологическим стандартам и контролю (см. сноску 2). Референтную сыворотку следует хранить в виде замороженных аликвот в количествах, достаточных для проведения тестов в течение одной недели. В лаборатории следует также готовить и включать в каждый тест положительный сывороточный контрольный стандарт, разведённый до иммуногенности 0, 5 МЕ/мл, и отрицательный сывороточный контрольный стандарт с иммуногенностью < 0, 1 МЕ/мл.
2. 2. 6. Опытные сыворотки
Перед тестированием сывороточные образцы следует нагревать при 560С в течение 30 минут с целью инактивации комплемента. Если сыворотки заморожены, то их следует повторно нагреть после оттаивания. Серийные разведения опытных сывороток можно приготовить на восьмилуночных предметных стёклах для культуры ткани. Скрининговые разведения 1/5 и1/50 достаточны для рутинной оценки эффективности вакцинации и могут проводиться следующим образом:
i i) Приготовьте разведение 1/2, 5 путём переноса 0, 1 мл инактивированной сыворотки и 0, 15 мл ЕМЕМ-10 на одно из предметных стёкол. Перемешайте путём осторожного покачивания предметного стекла.
i ii) Перенесите 0, 05 мл разведения 1/2, 5 во вторую лунку, содержащую 0, 45 мл ЕМЕМ-10. Удалите всё, кроме 0, 1 мл, из лунки, содержащей разведение 1/2, 5.
|
|
|
i iii) Перемешайте содержимое второй лунки и удалите всё, кроме 0, 1 мл.
i iv) Добавьте 0, 1 мл препарата контрольного вируса (содержащего 32-100 ФОД50) ко всем сывороточным разведениям.
i v) Перемешайте и инкубируйте при 35°С во влажном инкубаторе с 0, 5% СО2 в течение 90 минут.
2. 2. 7. Добавление клеток
i i) Во время периода инкубации подвергните трипсинизации исходную культуру 3-5-дневных клеток нейробластомы мышей.
i ii) Ресуспендируйте клетки в ЕМЕМ-10 до получения конечной концентрации 1х105 клеток на 0, 2 мл.
i iii) Поместите 0, 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку предметного стекла и инкубируйте при 35°С во влажном инкубаторе с 0, 5% СО2 ещё в течение 20 часов.
2. 2. 8. Фиксация в ацетоне и окрашивание с использованием реакции иммунофлуоресценции
i i) Через 20 часов удалите предметные стёкла из инкубатора и вылейте среду в вирулицидный раствор.
i ii) Ополосните предметные стёкла один раз в ЗФР, а затем зафиксируйте в течение 10 минут при комнатной температуре в холодном ацетоне (-200С).
i iii) Перед тем, как добавить конъюгированную с флуоресцеин изотиоцианатом антирабическую сыворотку, оставьте предметные стёкла на 10 минут для высыхания. Конъюгат можно готовить в ЕМЕМ - 10 или ЗФР; нет необходимости адсорбировать конъюгат тканью или клетками. Рабочее разведение конъюгата следует определять путём титрования. Предметные стёкла необходимо
i окрашивать в течение 20-30 минут при 370С, а затем ополаскивать в ЗФР и дистиллированной воде, соответственно.
i iv) Предметные стёкла следует изучать под флуоресцентным микроскопом.
2. 2. 9. Вычисление титров вируснейтрализующих антител
Остаточный вирус обнаруживают с использованием стандартного флуоресцентного микроскопа. Конечный титр сывороточной нейтрализации определяется как фактор наивысшего разведения сыворотки, при котором 50% наблюдаемых микроскопических полей содержат одну или более инфицированных клеток (а именно, 97% сокращение вирусного инокулята). Эту величину можно получить путём математической интерполяции. Альтернативно 100% титр нейтрализации можно получить путём регистрации наивысшего сывороточного разведения, при котором нейтрализуется 100% контрольного инокулята и ни в одном из наблюдаемых полей нет инфицированных клеток. При использовании обоих методов титрования титр антител в опытной сыворотке (в МЕ/мл) можно получить путём сравнения с титром национального референтного стандарта, включённого в каждый тест. Следует отметить, что можно также проводить быструю реакцию подавления флуоресцирующего фокуса с использованием клеток ВНК-21 вместо клеток нейробластомы. Для этого был опубликован модифицированный протокол (ВОЗ, 1996).
|
|
|
Необходимо строго придерживаться следующих параметров:
• • Вирус бешенства: может быть использован только штамм CVS-11.
• • Культуры клеток: должны использоваться только клетки ВНК-21 (АТСС номер CCL 10) или клетки MNA (АТСС номер CCL 131).
• • Тест можно проводить только с использованием предметных стекол Lab-tec.
• • Для вируса бешенства, незараженной сыворотки и положительной стандартной собачьей сыворотки должны использоваться контрольные карты.
• • Обратная титрация стандарта контрольного вируса (CVS), так же как незараженная сыворотка и положительная стандартная собачья должны быть на контрольном планшете.
• • Метод считывания результатов теста: каждое предметное стекло должно иметь 25-50 полей и наблюдаться при × 160-2000 увеличении.
• • Требуется как минимум 3-5-кратных разведений сыворотки.
• • При переводе log D50 в МЕ/мкл можно использовать только величину log D50 положительной стандартной собачьей сыворотки.
|
|
|
