 |
2.1.4. Титрация вируса в ТЦД50 (50% инфицирующая культуру ткани доза)
|
|
|
|
2. 1. 4. Титрация вируса в ТЦД50 (50% инфицирующая культуру ткани доза)
При этом методе титрации используют клетки ВНК-21 С13 (АТСС CCL-10) на титрационных микропланшетах.
Различные этапы данной процедуры можно адаптировать в соответствии с требованиями безопасности и рабочей практикой лаборатории, но не надо менять следующее:
• • инокуляция 24-часового клеточного слоя,
• • десятикратные разведения, приготовленные с использованием 0, 9 мл разбавителя и 0, 1 мл вирусной суспензии,
• • от четырех до шести 50 мкл воспроизведений на разведение,
• • инкубирование в течение 72х часов,
• • качественное считывание результатов (а именно, являются ли лунки положительными или отрицательными),
• • при каждой титрации титруется пузырёк с вирусом контрольной серии и этот титр вносится в контрольную карточку для валидации процесса титрации,
• • вычисление проводят согласно неопробит-графическому методу или методу Spearman-Kã rber.
i i) Клеточная суспензия: за день до титрации готовят клеточную суспензию, содержащую 105 клеток/мл, в клеточной культуральной среде, содержащей 10% инактивированную высокими температурами ФТС, и переносят на 96-луночные титрационные микропланшеты из расчёта 200 мкл на лунку. Планшеты затем инкубируют в течение 24 часов при 35, 50С-370С с 5% СО2.
i ii) Разведение вируса: серийные разведения проводят в 5 мл пробирках с использованием клеточной культуральной среды без ФТС в качестве
i разбавителя. Готовят десятикратные разведения от 10-1 до 10-12 (0, 9 мл разбавителя с 0, 1 м предшествующего разведения).
i iii) Заражение клеток: среду удаляют с титрационных микропланшетов с использованием системы отсасывания жидкости. В каждую лунку помещают 50 мкл каждого разведения вируса. На каждое разведение используют шесть воспроизведений. Затем титрационный микропланшет инкубируют в течение 1 часа при 35, 5 – 370С с 5% СО2. Затем добавляют 200 мкл клеточной культуральной среды, содержащей 5% ФТС.
|
|
|
i iv) Инкубирование: инкубирование проводят в течение 3х дней при 35, 5 – 370С с 5% СО2.
i v) Окрашивание и вычисление титра: Клетки окрашивают с помощью реакции флуоресцирующих антител, как это подробно изложено ниже. Подсчёт качественный, каждая лунка, которая демонстрирует специфическую флуоресценцию, считается положительной. Вычисление титра производится с использованием неопробит-графического метода или формулы Spearman-Kã rber (ВОЗ, 1996).
ii vi) Титрация стандарта контрольного вируса должна проводиться посредством реакции вируснейтрализации с флуоресцирующими антителами для установления инфицирующей дозы ЦПД50.
2. 1. 5. Процедура проведения теста
i i) Микропланшеты применяют в соответствии с образцом Рисунка 1. Планшет №1 используется для титрования стандарта контрольного вируса (ряды с 1 по 4), для контролей, стандартных сывороток и незаражённой собачьей сыворотки. Другие планшеты используются для тестируемых сывороток.
i ii) Среду добавляют в лунки следующим образом: планшет 1, ряды с 1 по 4 и лунки с А 9 по А12: 150 мкл на лунку; другие планшеты, ряды 6 и 12: 200 мкл на лунку; и другие лунки: 100 мкл.
i iii) Тестируемые сыворотки подвергают термоинактивации в течение 30 минут при 560С. Как указано на Рисунке 1, 50 мкл каждой неразведённой опытной сыворотки добавляют в четыре соседние лунки.
i iv) Разведения сыворотки проводят на микропланшетах следующим образом:
Сыворотка МЭБ, сыворотка ВОЗ, внутренний контроль и незаражённая собачья сыворотка: с помощью 50-200 мкл многоканальной пипетки перемешайте первое разведение путём всасывания и выливания, по меньшей мере, восемь раз, переносите 50 мкл из одного ряда в следующий ряд до тех пор, пока не дойдёте до последнего. Удалите 50 мкл из последнего ряда.
|
|
|
Если на контрольном планшете есть тестируемая сыворотка, посмотрите ниже на этап разведения.
Требуется, как минимум, четыре трехкратных разведения.
Тестируемые сыворотки (все планшеты): как это указано выше, перенесите последовательно 50 мкл из одного ряда в следующий до рядов 5 и 11 (разв. 10-2, 39). С помощью 5-50 мкл многоканальной пипетки перенесите 10 мкл из рядов 5 и 11 в ряды 6 и 12, соответственно (из разв. 10-2, 39 в разв. 10-4, 23). С помощью многоканальной пипетки, установленной на 90 мкл, смешайте сыворотки рядов 6 и 12 и выбросьте 180 мкл. Затем добавьте в эти ряды 70 мкл среды. Этот конечный этап не годится для тестирования с высокой пропускной способностью. Для того, чтобы получить или превысить рекомендуемое конечное разведение, можно использовать альтернативные процедуры. Они могут потребовать модификаций в разбивке планшета.
Рис. 1. Предлагаемое использование микропланшетов для реакции вируснейтрализации с флуоресцирующими антителами. Лунки, в которые вносят неразведённые сыворотки, помечены «50 мкл». Лунки, в которые должны быть добавлены 50 мкл разведённого стандарта контрольного вируса, заштрихованы. Разведения выражены в log10.
Планшет 1: Контроли
log (разведение) 0, 48 0, 95 1, 43 1, 91 2, 39 2, 87 Контроль вируса CVS клеток
|
|
|
