 |
В. Диагностические методы. 1. Идентификация возбудителя 1. 1. Микроскопическое исследование. 1. 2. Культивирование. 1. 3. Методы распознавания нуклеиновой кислоты
|
|
|
|
В. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Если диагностические методики используются в рамках официальной программы по контролю и искоренению туберкулеза, то компетентному органу в области ветеринарии рекомендовано:
• • Утвердить диагностические тесты (тест);
• • Уполномочить лабораторию, проводящую данное тестирование; и
• • Выдать разрешением тем специалистам, которые применяют указанные диагностические методики на животных, а именно кожные пробы.
1. Идентификация возбудителя 1. 1. Микроскопическое исследование
1. 2. Культивирование
1. 3. Методы распознавания нуклеиновой кислоты
У КРС, как правило, клинические признаки туберкулеза не проявляются до появления обширных поражений. По этой причине, диагностика туберкулеза у отдельных животных и реализация программ по искоренению не представлялись возможными до того момента, пока Кох не получил туберкулин в 1890 году. Туберкулин, концентрированный стерильный культуральный фильтрат туберкулезной палочки, выращенный на глицериновом мясном бульоне, а в последнее время, на синтетической среде, представляет собой средство обнаружения болезни. Поскольку кожные пробы иногда имеют практические недостатки, то в попытке разработать усовершенствованные или альтернативные диагностические методы проводили изучение иммунологических ответов на заражение КРС M. bovis. Для диагностика туберкулеза у КРС и других животных (например, коз, буйволов) все чаще используется диагностический тест крови на выявление гамма-интерферона, данный тест имеется в продаже. Свою пригодность в качестве дополнительных (усиление специфичности) и параллельных тестов (усиление чувствительности) продемонстрировали тест пролиферации лимфоцитов и твердофазный иммуноферментный анализ ИФА для определения IgG1, (применяется в отношении разводимых на ферме благородных оленей).
|
|
|
Присутствие M. bovis в клинических образцах, и образцах, взятых после смерти, можно выявить при исследовании окрашенных мазков или тканевых срезов и подтвердить при культивировании организма на среде для первичного выделения. Контейнеры для сбора образцов должны быть чистыми, предпочтительно стерильными (использование контейнеров для образцов, контаминированных микобактериями из окружающей среды, может помешать идентификации инфекции M. bovis по причине быстрого роста микобактерий из окружающей среды); по возможности, необходимо использовать одноразовые, пластиковые контейнеры вместимостью 50 мл. Они подходят для различных типов образцов. Образцы, которые подлежат отправке в лабораторию, необходимо уложить на подушку и закупорить во избежание утечки, а также упаковывать надлежащим образом, чтобы не допустить повреждений при перевозке. При поставке образцов, которые могут включать возбудителей зоонозных болезней, следует соблюдать правила перевозки опасных грузов Международной ассоциации воздушного транспорта (IATA), Регламенты по работе с опасными грузами (DGR). Требования кратко изложены в Главе 1. 1. 2. Сбор, доставка и хранение диагностических образцов и Главе 1. 1. 3. Транспортировка образцов животного происхождения. Своевременная доставка образцов в лабораторию увеличивает вероятность выделения культуры M. bovis, однако, если ожидаются задержки при поставке, образцы необходимо охладить или заморозить с целью сдерживания роста контаминантов и сохранения микобактерий. В теплых условиях,
когда невозможна заморозка, можно добавить борную кислоту (конечная концентрация 0, 5 % [в / о]) в качестве бактериостатического агента, но только для ограниченного периода времени, не дольше одной недели. Необходимо соблюдать меры предосторожности, чтобы избежать заражения персонала лаборатории (смотрите Главу 1. 1. 4. Биобезопасность и биозащита: Стандарт работы с материалами биологического риска в ветеринарной лаборатории и в виварии). Все процедуры, в которых используют культуры, необходимо проводить в ламинарном боксе с биологической защитой.
|
|
|
Mycobacterium bovis можно выявить под микроскопом на прямых мазках от клинических образцов, а также на приготовленных тканевых материалах. Кислотоустойчивость M. bovis, как правило, выявляют при помощи классического красителя Ziehl-Neelsen, но также можно использовать флуоресцентный кислотоустойчивый краситель. Удовлетворительные результаты также можно получить при использовании иммунопероксидазного метода. Предположительный диагноз микобактериоза можно поставить в том случае, если в тканях имеются характерные гистологические поражения (творожистый некроз, минерализация, эпителиоидные клетки, многоядерные гигантские клетки и макрофаги).
Поскольку поражения часто отличаются олигобациллярностью, то наличие кислотоустойчивых организмов в гистологических срезах можно и не выявить, несмотря на то, что M. bovis может быть выделен в культуре. Однако большое количество кислотоустойчивых организмов наблюдают в поражениях у приматов, кошачьих, куньих (барсуки) и сумчатых (щеткохвостые поссумы).
С целью обработки образцов для культивирования, в первую очередь образцы гомогенизируют с помощью пестика и ступки, гомогенизатора или мешалки, далее деконтаминируют либо детергентом (например, 0, 375-0, 75% гексадецилпиридиний хлорид [HPC]), либо щелочью (2-4% гидроксид натрия) или кислотой (5% щавелевая кислота). Смесь (щелочную или кислотную) встряхивают в течение 10-15 минут при комнатной температуре, затем нейтрализуют. При использовании НРС нейтрализация не требуется. Суспензию центрифугируют, супернатант отбраковывают, а осадок используют для культивирования и исследования под микроскопом. Рекомендуется в
качестве обязательного минимума культивировать собранные в пулы пробы лимфатических узлов головы и грудной клетки, когда видимых поражений не выявлено у животных, продемонстрировавших по результатам аутопсии положительные реакции в тестах на туберкулин или интерферон.
|
|
|
Для первичного выделения, осадок обычно засевают на набор твердых яичных сред, таких как Lowenstein-Jensen, Coletsos или Stonebrinks, эти среды должны содержать либо пируват, либо глицерин и пируват. Также следует использовать агаровую среду, например, среду Middlebrook 7H10 или 7H11 или агаровую среду на основе крови (Cousins et al., 1989).
Культуры инкубируют в течение минимум 8 недель (предпочтительно 10-12 недель) при температуре 370С с СО2 или без него. Среда должна находиться в плотно закрытых пробирках, чтобы предотвратить высыхание. Скошенные среды исследуют на макроскопический рост в интервалах во время периода инкубации. Когда рост становится заметным, готовят мазки и окрашивают их методом Ziehl-Neelsen. Рост M. bovis заметен обычно после 3 – 6 недель инкубации в зависимости от используемой среды.
В некоторых больницах и ветеринарных лабораториях в повседневной практике используют системы жидких культур; в этих системах рост измеряют с помощью радиометрических или флуориметрических средств.
Если обнаруживают признаки сильной контаминации, то процесс культивирования следует повторить, используя сохранённые инокуляты с альтернативным деконтаминирующим агентом. Фактором, ограничивающим возможность выделения, часто выступает низкое качество представленных проб, поэтому необходимо приложить все усилия, чтобы лаборатория получила пробы надлежащего качества.
На основе характерных паттернов роста и колониальной морфологии можно провести предварительную диагностику M. bovis; однако, для каждого изолята необходимо подтверждение. Необходимо четко отличать M. bovis от других членов «туберкулезного комплекса», а именно от M. tuberculosis (первичная причина туберкулеза у людей), M. africanum (занимает промежуточное фенотипическое положение между M. tuberculosis и M. bovis), M. microti (бацилла мышей полевок, редко встречающийся организм), M. pinnipedii и M. caprae.
Mycobacterium tuberculosis может заразить КРС и сделать его восприимчивым к туберкулину для КРС без появления каких-либо типичных поражений. Иногда у КРС из поражений, напоминающих поражения при туберкулезе, можно выделить M. avium или другие микобактерии окружающей среды. В таком случае необходима тщательная идентификация, чтобы исключить смешанное заражение M. bovis.
|
|
|
Идентификацию изолятов обычно проводят посредством определения традиционных культуральных и биохимических свойств. На подходящей твердой среде, основанной на пирувате, колонии M. bovis гладкие и белые с желтоватым оттенком. Организм растет медленно при температуре 37°С, но он не растет при 22°С или при 45°С. Mycobacterium bovis чувствительна к гидразиду тиофен – 2 - карбоновой кислоты (TCH) и к гидразиду изоникотиновой кислоты (INH). Это можно проверить посредством роста на агаровой среде Middlebrook 7H10 / 7H11 или на яичной среде. Яичную среду следует готовить без добавления пирувата, потому что он подавляет гидразид изоникотиновой кислоты и оказывать схожее влияние на гидразид тиофен – 2 – карбоновую кислоту (они являются аналогами), таким образом, давая ложноположительные (резистентные) результаты. Штаммы Mycobacterium bovis также чувствительны к пара-амино салициловой кислоте и стрептомицину. Эффективные концентрации препарата разные для яичной среды и среды на основе агара. Результаты по продуцированию никотиновой кислоты и снижению нитрата отрицательные у M. bovis. В реакции с использованием амидазы, M. bovis является положительной в отношении уреазы и отрицательной в отношении никотинамидазы и пиразинамидазы. Это микроаэрофильная и нехромогенная бактерия.
Экспресс идентификацию изолятов до уровня комплекса M. tuberculosis можно провести с помощью Gen Probe TB комплексного ДНК-зонда или полимеразной цепной реакции (ПЦР), нацеленной на 16S-23S рРНК; при этом используются инсерционные последовательности IS6110 и IS1081 и гены, кодирующие белки, специфичные для комплекса M. tuberculosis, например, MPB70 и 38kDA антиген b.
Специфическую идентификацию изолята можно провести с помощью ПЦР, нацеленной на мутацию в нуклеотидных позициях 285 в гене oxyR, 169 в гене pncA, 675/756/1311/1410 и 1450 в гене gyrB и на наличие\отсутствие областей различия гена (RD) (Espinosa de los Monteros et al., 1998; Huard et al., 2003; Niemann et al., 2000;
Parsons et al., 2002). В качестве альтернативы для методики молекулярного типирования сполиготипирование, например, позволяет идентифицировать изоляты M. bovis и предоставляет информацию о молекулярном типировании изолята, представляющего эпидемиологическую ценность (Kamerbeek et al., 1997).
Полимеразная цепная реакция прошла всестороннюю оценку с точки зрения ее способности обнаружения комплекса M. tuberculosis в клинических образцах (в основном в мокроте) у людей, и недавно ее стали использовать для диагностики туберкулеза у животных. Была проведена оценка широкого ряда имеющихся в продаже наборов и различных внутрихозяйственных методов для обнаружения комплекса M. tuberculosis в свежих и зафиксированных тканях. Для данных целей пользовались различными праймерами, перечисленными выше. Продукты амплификации анализировали с помощью гибридизации с зондами или с помощью электрофореза в геле. Коммерческие наборы и внутрипроизводственные методы, применяемые на свежих, замороженных тканях или тканях, законсервированных в борной кислоте, демонстрировали изменчивые и не особо удовлетворительные результаты при межлабораторном сравнении (Noredhoek et al., 1996). Ложноположительные и ложноотрицательные результаты, особенно для образцов, в которых содержатся небольшие количества бацилл, снизили достоверность данных тестов. Непостоянство результатов объяснятся низким содержанием числа копий последовательности-мишени на бациллу в сочетании с низким содержанием бацилл.
|
|
|
Непостоянство также связывали с использованием методов деконтаминации, процедур экстрагирования ДНК, методов для исключения ингибиторов полимеразного фермента, внешних и внутренних контролей и процедур, направленных на предотвращение перекрестной контаминации. Усовершенствование надежности полимеразной цепной реакции, как практического теста для обнаружения комплекса M. tuberculosis в свежих клинических образцах, потребует разработки стандартизированных и надежных процедур. Перекрестная контаминация представляет существенную проблему для данного применения, поэтому при каждой амплификации требуются надлежащие проверки. Однако в некоторых лабораториях в настоящее время ПЦР используется в качестве рутинного теста для обнаружения группы бактерий M. tuberculosis в тканях, залитых парафином (Miller et al., 1997; 2002). Хотя прямой ПЦР может выдавать быстрые результаты, рекомендуется параллельное использование культуры для подтверждения наличия жизнеспособного M. bovis.
Разработаны разные методики ДНК фингерпринтинга, чтобы установить отличия изолятов комплекса M. tuberculosis для эпизоотологических целей. Эти методы могут выявлять отличия между разными штаммами M. bovis и позволяют описать паттерны происхождения, передачи и распространения M. bovis (Durr et al., 2000a; 2000b).
Чаще всего используется метод сполиготипирования (от «спейсерного олиготипирования»), который позволяет дифференцировать штаммы внутри каждого вида, принадлежащего к комплексу M. tuberculosis, включая M. bovis, с помощью него также можно провести дифференциацию между M. bovis и M. tuberculosis (Heifets & Jenkins, 1998; Kamerbeek et al., 1997). Поощряется использование стандартной номенклатуры для сполиготипов в соответствии с базой данных Mbovis. org (http: //www/mbovis. org), что позволяет проводить международное сравнение профилей.
К другим методикам относятся анализ рестрикционной эндонуклеазы (REA) и полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с зондом IS6110 (особенно, если в изоляте > 3-4 копий IS6110), зондом участка прямой повторности (DR), зондом PGRS (полиморфная GC повторная последовательность) (Skuce et al., 1996) и зондом pUCD (O’Brian et al., 2000). Был разработан вариант типирования MIRU-VNTR (микобактериальные, рассеянные повторяющиеся единицы (MIRU) – вариабельные тандемные повторы), позволяющий еще очевидней продемонстрировать разницу видов, входящих в комплекс M. tuberculosis (Frothingham & Meeker-O’Connell, 1998; Supply et al., 2000). Для максимальной дифференциации между штаммами можно воспользоваться сочетанием методов (Cousins et al., 1998).
Геном M. bovis был секвенирован (Garnier et al., 2003) и полученная в результате информация позволила значительно усовершенствовать методы генетического фингерпринтинга и разработать анализы ПЦР, которые определяют подвиды комплекса M. tuberculosis.
|
|
|
