 |
2. Метод производства. 3. Контроль в процессе производства. 4. Контроль партии 4.1. Стерильность. 4.2. Безопасность. 4.3. Сенсибилизирующий эффект
|
|
|
|
2. Метод производства
Организм культивируют в синтетической среде, протеин в фильтрате преципитируют химическим способом (используя сульфат аммония или трихлоруксусную кислоту (ТСА)), затем промывают и ресуспендируют. Рекомендуется использовать ППД туберкулин, поскольку его можно стандартизировать более точно. Можно также добавить антимикробный консервант, препятствующий возникновению ложноположительных реакций, например, фенол (не более 5% [в/о]). Глицерин (не более 10% [в/о]) или глюкозу (2, 2 % [в/о]) можно добавить в качестве стабилизаторов. Не следует использовать дериваты ртути. Продукт распределяют в асептических условиях в стерильные стеклянные контейнеры, которые затем герметично закрывают с целью предотвращения контаминации. Продукт можно лиофилизировать.
3. Контроль в процессе производства.
Флаконы, используемые в производстве, содержащие подходящие посевные культуры, инкубируют в течение соответствующего периода времени. Любую колбу, в которой обнаружена контаминация и рост, сильно отклоняющийся от нормы, после автоклавирования необходимо отбраковывать. Во время инкубации поверхность многих культур может увлажниться и погрузиться в среду, или на дно флакона. Что касается ППД туберкулинов, рН растворенного преципитата (так называемый концентрированный туберкулин) должен быть 6, 6 – 6, 7. Уровень протеина концентрата ППД определяют методом Кьельдаля или другим подходящим методом. Обычно сравнивают общий азот и азот, преципитированный с использованием трихлоруксусной кислоты. Необходимо провести биологические анализы готового продукта на морских свинках. Анализы специфичности и иммуногенности проводят в сопоставлении с референтным туберкулином (ППД). Дальнейшие разведения готовят при использовании буфера в соответствии с содержанием белка и требуемой конечной концентрацией, обычно, 1. 0 мг/мл (Angus, 1978; Haagsma & Angus, 1994).
|
|
|
4. Контроль партии 4. 1. Стерильность
4. 2. Безопасность
4. 3. Сенсибилизирующий эффект
4. 4. Иммуногенность 4. 4. 1. Стандартизация на морских свинках
4. 4. 2. Стандартизация туберкулина для КРС на КРС
4. 5. Специфичность
4. 6. Стабильность
4. 7. РН контроль
4. 8. Содержание белка
4. 9. Хранение
4. 10. Консерванты
4. 11. Меры предосторожности (угрозы)
Образцы должны соответствовать официально признанным стандартам производства туберкулина, установленным Европейской фармакопеей или эквивалентным регулирующим стандартом.
Тест на стерильность обычно проводят в соответствии с международными руководствами (см. также Главу I. 1. 9. Тесты биологических материалов на стерильность и свободу от контаминации).
Двум морским свинкам, вес каждой из которых не менее 250 г, и которые ранее не подвергались воздействию никаких препаратов, препятствующих проведению теста, подкожно вводят 0, 5 мл тестируемого туберкулина. В течение 7 последующих дней никаких явлений, отклоняющихся от нормы, быть не должно. Туберкулиновые пробы на наличие живых микобактерий можно проводить на туберкулине непосредственно до его распределения в готовые контейнеры, или на образцах, взятых из самих готовых контейнеров. Необходимо взять образец минимум 10 мл и ввести его внутрибрюшинно минимум двум морским свинкам, разделяя дозу между ними. Желательно использовать образец большего объема, например, 50 мл и концентрировать любые остаточные микобактерии путем центрифугирования или мембранной фильтрации. За морскими свинками наблюдают минимум в течение 42 дней, затем проводят макроскопическое исследование при аутопсии. Любые обнаруженные поражения исследуют при помощи микроскопа и при культивировании.
|
|
|
Чтобы проверить сенсибилизирующий эффект, трем морским свинкам, которых раньше не подвергали воздействию никаких препаратов, препятствующих проведению теста, подкожно вводят в каждом из трех случаев эквивалент 500 МЕ тестируемого препарата объемом 0, 1 мл.
Каждой морской свинке, вместе с каждой из трех контрольных морских свинок, которым до этого момента не делали инъекцию, через 15-21 день после третьей инъекции подкожно вводят такую же дозу того же туберкулина. Реакции в двух группах морских свинок не должны значительно отличаться при измерении через 24 – 28 часов.
Иммуногенность проверяют посредством сравнения с референтным препаратом туберкулина для КРС на морских свинках, сенсибилизированных M. bovis.
Еще в 1960-х годах страны Европейского Экономического Сообщества (ЕЭС, в настоящее время ЕС) признали ЕЭС стандарт для ППД для КРС, иммуногенность которого установили на уровне 50 000 прогнозируемых туберкулиновых единиц Сообщества на мг ППД, и распределили в лиофилизированном виде. К сожалению, количество ампул с лиофилизированным препаратом было недостаточным для того, чтобы соответствовать требованиям ВОЗ, поэтому было решено произвести новый препарат ППД для КРС, который в соответствии с ВОЗ мог бы считаться новым международным стандартом для ППД туберкулинов для КРС.
Этот новый стандарт ППД для КРС необходимо было калибровать в сопоставлении с существующим стандартом ЕЭС. На основе совместных международных анализов, проводимых на морских свинках и на КРС, было обнаружено, что новый стандарт для КРС имеет относительную иммуногенность 65% в сравнении со стандартом ЕЭС. Поэтому в 1986 году ВОЗ официально определила международный стандарт для ППД туберкулинов для КРС на уровне 32, 500 МЕ/мг. Это означает, что прогнозируемые туберкулиновые единицы Сообщества равнозначны МЕ. Европейская фармакопея также признала международный стандарт ВОЗ для ППД туберкулина для КРС.
Для сохранения запасов актуального международного стандарта, желательно, чтобы страны, производящие ППД туберкулин для КРС, установили в качестве рабочих стандартов свои национальные референтные препараты для ППД для КРС. Эти национальные референтные препараты необходимо калибровать по официальному международному стандарту для ППД для КРС, как на морских свинках, так и на КРС (Maxlid et al., 1976; Schneider et al., 1979; WHO, 1987).
|
|
|
Морских свинок сенсибилизируют при введении низкой дозы (например, 0, 001 или 0, 0001 мг массы сырого вещества) живых бацилл вирулентного штамма M. bovis за 5 – 7 недель до анализа. Бациллы суспендируют в физиологическом растворе, и затем глубоко внутримышечно вводят 1 мл в среднюю часть бедра. Во время анализа, морские свинки, которых инфицировали низкой дозой M. bovis, должны оставаться здоровыми, а результаты многочисленных аутопсических исследований, которые проводят сразу после стандартизированных анализов, должны свидетельствовать о том, что у морских свинок не наблюдается открытая форма туберкулеза, и, таким образом, они не выделяют туберкулезные бациллы.
Можно использовать альтернативный тест на иммуногенность, для проведения которого не требуются живые патогенные микобактерии, и который более подходит для лабораторий, где нет изолированных площадей для надежного содержания инфицированных морских свинок. Кроме того, данный вариант более удобен с точки зрения обеспечения благополучия экспериментальных животных.
Данный тест на иммуногенность туберкулина проводят следующим образом: биологическую пробу ППД туберкулина проводят на гомологически сенсибилизированных морских свинках в сопоставлении со стандартом для ППД туберкулина для КРС при помощи восьмиэтапного анализа, включающего 4 разведения, соответствующие 20, 10, 5 и 2, 5 МЕ.
Объем инъекции составляет 0, 1 мл. При проведении этого анализа два тестируемых туберкулина сравнивают со стандартным туберкулином на восьми морских свинках, вводя восемь внутрикожных инъекций каждому животному, придерживаясь полного уравнивания по схеме латинского квадрата. Морских свинок сенсибилизируют инактивированными бациллами M. bovis за 5 – 7 недель до проведения анализа. Бациллы суспендируют в буфере и превращают в эмульсию с использованием адъюванта Фрейнда. В среднюю часть бедра делают глубокую внутримышечную инъекцию. Доза инъекции составляет 0, 5 мл.
|
|
|
Подходящий анализ на иммуногенность проводят следующим образом: Выработанные туберкулины ППД подвергают биологическому анализу на гомологически сенсибилизированных морских свинках в сопоставлении со стандартом для туберкулина ППД для КРС. Анализ включает 6 этапов, 3 разведения каждого туберкулина с пятикратными интервалами. Разведения туберкулиновых препаратов проводятся в изотоническом буферном растворе, содержащем 0, 0005% (в/о) полисорбат 80 (Tween 80). Объемы 0, 001, 0, 0002 и 0, 00004 мг туберкулопротеина, соответствующие международному стандарту для ППД на уровне 32, 6, 4 и 1, 28 МЕ соответственно, выбирают потому, что эти количества дают хорошо считываемые кожные реакции с допустимыми пределами. Объем инъекции составляет 0, 2 мл. В одном анализе два тестируемых туберкулина сравнивают со стандартным туберкулином, испытывая его на 9 морских свинках, при помощи 8 внутрикожных инъекций для каждого животного, и придерживаясь полного уравнивания по схеме латинского квадрата (Finney, 1964).
Обычно, результаты анализа исследуют через 24 часа после введения туберкулина, но через 48 часов можно провести второе дополнительное считывание результатов. Разные диаметры эритемы измеряют при помощи штангенциркуля в миллиметрах и записывают в таблицы результатов анализа. Затем проводится статистическая оценка результатов при использовании статистических методов для параллельных анализов, в соответствии с Finney (1964). Показатели относительной иммуногенности двух тестируемых туберкулинов подсчитывают с пределом достоверности 95%, наклонами кривых ответной реакции на десятичный логарифм дозы для каждого препарата (увеличение среднего показателя реакции на единицу увеличения в десятичной дозе логарифма) и F соотношений для отклонений от параллелизма.
В соответствии с Европейской фармакопеей, оцененная иммуногенность туберкулинов для КРС должна быть не менее 66% и не более 150% иммуногенности, указанной на ярлыке.
Согласно техническому отчету ВОЗ по серии №384 тестирование иммуногенности необходимо проводить на тех видах животных, для которых предназначен указанный туберкулин, и в тех условиях, в которых тестируемые туберкулины будут использоваться на практике (ВОЗ, 1987). Это означает, что туберкулины для КРС следует тестировать на КРС, который подвергся естественному заражению туберкулезом. Поскольку это требование трудно выполнить, рутинное тестирование иммуногенности проводят на морских свинках. Однако необходимо периодическое тестирование на зараженном туберкулезом КРС, а стандартные препараты необходимо калибровать всегда на КРС. Частоту тестирования на КРС можно сократить при уверенности в том, что стандартные препараты характерны для рутинно используемых туберкулинов, и что процедуры производства гарантировано последовательны.
|
|
|
Подходящий анализ на иммуногенность бычьих туберкулинов проводится по следующей схеме: Туберкулины тестируют в сравнении со стандартом для туберкулина ППД для КРС с помощью четырехэтапного анализа, используя 2 разведения каждого туберкулина с пятикратными интервалами. Для стандарта,
вводят 0, 1 и 0, 02 мг туберкулопротеина, поскольку эти объемы, соответствуют 3250 и 650 МЕ, если используется международный стандарт для туберкулина ППД для КРС. Тестируемые туберкулины разводят таким образом, чтобы применять такую же массу протеинов. Объем инъекции составляет 0, 1 мл, и расстояние между участками инъекции на средней поверхности шеи составляет 15 – 20 см. В одном анализе три тестируемые туберкулина сравнивают со стандартным туберкулином, используя восемь голов КРС, зараженных туберкулезом, и применяя по восемь внутрикожных инъекций для каждого животного (с обеих сторон шеи и придерживаясь полного уравнивания по схеме латинского квадрата).
Толщину кожи на участке каждой инъекции измеряют при помощи штангенциркуля до десятой доли миллиметра, как можно точнее до инъекции и через 72 часа после инъекции (Haagsma et al., 1984).
Статистическая оценка результатов проводится с использованием тех же стандартных методов для параллельных анализов, которые были использованы для проверки иммуногенности на морских свинках.
Анализ на специфичность проводится следующим образом: три туберкулина ля КРС тестируют в сравнении со стандартом для туберкулина ППД для КРС (или три тестируемых туберкулина для птиц тестируют в сопоставлении со стандартом для туберкулина ППД для КРС). Анализ состоит из четырех этапов и проводится на гетерологически сенсибилизированных морских свинках, включает два разведения каждого туберкулина с 25-кратными интервалами. Выбирают количества 0, 03 мг и 0, 0012 мг тестируемого туберкулопротеина, соответствующие 975 и 39 МЕ, поскольку эти дозы дают хорошо различимые кожные реакции. Стандартные дозы для инъекций ниже, а именно 0, 001 мг и 0, 0004 мг. В одном анализе тестируемые туберкулины сравнивают со стандартным туберкулином, используя восемь морских свинок, проводя восемь внутрикожных инъекций для каждого животного и придерживаясь полного уравнивания по схеме латинского квадрата. Считывание результатов и статистическая оценка являются идентичными анализу на иммуногенность.
При условии, что туберкулины соответствуют законодательно установленным стандартам производства и хранятся при температуре 2 – 80С в защищенном от света месте, их можно использовать до окончания срока хранения, указанного в лицензии на
производство туберкулина. Для более длительного хранения рекомендуется держать ППД в концентрированной, а не в разведенной форме. Концентрат также необходимо хранить в защищенном от света месте.
рН должен быть 6, 5 – 7, 5.
Содержание белка определяется способом, указанным в Разделе С. 3. Контроль в процессе производства.
Туберкулин для КРС в жидкой форме необходимо хранить в защищенном от света месте при температуре 5±30С. Заморозка жидких продуктов может ухудшить качество. Однако можно подготовить лиофилизированные препараты и хранить их при более высоких температурах (но не превышающих 250С) в защищенном от света месте. Периоды воздействия более высоких температур или прямых солнечных лучей должны быть сведены к минимуму.
Необходимо проверять, чтобы антимикробные консерванты или другие вещества, которые добавляют к туберкулину, не снижали его безопасность и эффективность.
Максимальная допустимая концентрация фенола составляет 0, 5% (в/о), глицерина – 10% (о/о).
Опыт наблюдения за людьми и животными показывает, что разведенный надлежащим образом туберкулин, введенный внутрикожно, вызывает ограниченную реакцию на участке введения без генерализованных проявлений болезни. Даже у очень чувствительных особей, тяжелые, генерализованные реакции чрезвычайно редки и ограничены. Однако опыт показывает, что у специалиста с повышенной чувствительностью могут наблюдаться тяжелые генерализованные симптомы после случайного внутрикожного контакта (рана от укола иглой) с туберкулином для КРС. Таким людям не рекомендуется ставить туберкулиновую пробу с высокой дозой
туберкулина – 2000 – 5000 МЕ, что в 1000 раз превышает нормальную дозу для человека 5 МЕ.
|
|
|
