3. Лабораторные анализы крови

В настоящее время кроме классической внутрикожной туберкулиновой пробы стали доступны новые диагностические тесты, проводимые на образцах крови (Haagsma, 1993). Из-за высокой стоимости и более сложной процедуры проведения такие лабораторные анализы обычно используют в качестве дополнительных тестов для максимального выявления зараженных животных (параллельное тестирование); или подтверждения\отрицания результатов внутрикожной пробы (серийное тестирование). Доказано, что при постановке кожной пробы зараженному животному в течение последующей недели может проявиться усиленная реакция крови. Указанные наблюдения позволяют лучше разграничить ответные реакции на тест крови in-vitro, повысив тем самым точность тестирования. Реакция пролиферации лимфоцитов и гамма-интерферонный анализ измеряют клеточный иммунитет, в то время как ИФА измеряет гуморальный иммунитет.

При проведении этого анализа измеряется высвобождение лимфокина (гамма интерферона IFN-γ ) в системе культуры цельной крови. Анализ основан на высвобождении гамма-интерферона из сенсибилизированных лимфоцитов во время 16 – 24 часового периода инкубации со специфическим антигеном (очищенный протеиновый дериват туберкулина ППД) (Wood et al., 1990). В тесте используется сравнение продуцирования гамма-интерферона после стимуляции ППД для КРС и ППД

для птиц. Обнаружение гамма-интерферона КРС проводится при помощи сэндвич-варианта ИФА, в котором используют два вида моноклональных антител к гамма-интерферону КРС. Рекомендуется доставлять образцы крови в лабораторию и проводить тест в кратчайшие сроки, но не позднее, чем через день после отбора образцов крови (Coad et al., 2007; Ryan et al., 2000). Ряд опасений был высказан относительно точности теста в тех регионах, где широко распространена «неспецифичность». Однако благодаря способности IFN-γ теста выявлять раннее заражение, параллельное использование двух тестов позволяет выявить большее количество зараженных животных еще до того, как они станут источником инфекции для других животных, или источником контаминации окружающей среды (Gormley et al., 2006). Применение специально подобранных микобактериальных антигенов ESAT-6 и CFP10, повышает специфичность теста (Buddle et al., 2001). Эти антигены используют в ряде стран, например, в Соединенном Королевстве и Новой Зеландии для серийного тестирования. Применение таких антигенов также делает возможным дифференцировать животных, вакцинированных от BCG, от невакцинированных животных. Если речь идет о животных, с которыми трудно обращаться, например, легковозбудимый КРС или другие представители семейства bovidae, то преимущество IFN-γ теста над кожной пробой заключается в том, что животных необходимо поймать только один раз. IFN-γ тест был утвержден для использования в рамках некоторых национальных программ, включая программы Европейского Союза (ЕС), США, Новой Зеландии, Австралии. Например, в Новой Зеландии и Соединенном Королевстве IFN-γ тест используется для серийного тестирования (чтобы усилить специфичность) и в параллельном тестировании (чтобы усилить чувствительность). Тест доступен в коммерческих наборах для КРС и приматов; однако валидирован он лишь для немногих видов.

Этот тип анализа in-vitro сравнивает реактивность лимфоцитов периферической крови по отношению к очищенному белковому деривату туберкулина (ППД-В) и ППД из Mycobacterium avium (ППД-А). Реакцию можно проводить как на цельной крови (Buddle et al., 2001), так и на очищенных лимфоцитах из образцов периферической крови (Griffin et al., 1994). При помощи этих тестов предпринимаются попытки увеличить специфичность анализа посредством удаления ответов лимфоцитов на «неспецифические» или перекрестно реагирующие антигены, связанные с непатогенными видами микобактерий, воздействию которых животное могло

подвергаться. Результаты обычно анализируют как показатели, полученные при ответе на очищенный белковый дериват В минус показатель, полученный при ответе на очищенный белковый дериват А. Показатель В – А должен быть выше точки разделения, которую можно изменить для того, чтобы увеличить до предела либо специфичность, либо чувствительность диагноза. Анализ имеет научную ценность, но он не используется в качестве рутинного метода диагностики, потому что требует временных затрат, и проведение анализа в лабораторных условиях затруднено (для этого требуется длительная инкубация и использование радиоактивных нуклеотидов). Как и в случае с IFN-γ тестом, реакцию пролиферации лимфоцитов следует проводить сразу после отбора крови. Тест может быть полезным для диких животных и животных из зоопарка. Сообщалось, что анализ крови, включающий анализ бластогенеза лимфоцитов и ИФА, имеет высокую чувствительность и специфичность при диагностике заражения M. bovis среди оленей (Griffin et al., 1994). Этот тест является относительно дорогостоящим, и он еще не подвергался межлабораторным сравнениям.

Было предпринято много неудачных попыток разработать полезные с клинической точки зрения серодиагностические тесты для обнаружения туберкулеза. ИФА оказался самым подходящим вариантом теста для обнаружения антител, и он может быть скорее дополнением, чем альтернативой для тестов на основе клеточного иммунитета. Этот анализ можно использовать для КРС и оленей с подавленным иммунитетом.

Преимущество ИФА состоит в его простоте, но чувствительность ограничена по причине запоздалой и нерегулярной выработки гуморального иммунного ответа у КРС в течение болезни. Специфичность в этом случае тоже ограничена, если используются комплексные антигены, такие как туберкулин или культуральный фильтрат M. bovis. Однако сравнение уровней антител к ППД-В и ППД-А оказалось эффективным для увеличения специфичности в ИФА (Griffin et al., 1993). Однако гуморальный иммунный ответ у оленей вырабатывается ранее и более предсказуемо, и отмечено, что чувствительность сравнительного ИФА доходит для этого вида вплоть до 85 % (Griffin et al., 1993). Возможно усовершенствование при использовании комбинации различных антигенов, включая белки (например, MPB70 и MPB83, которые являются специфичными, но не обладают достаточной чувствительностью). Более того, в отношении животных, зараженных M. bovis, было описано анамнестическое увеличение, которое позволило получить лучшие результаты в ИФА через 2 – 8 недель после проведения стандартной туберкулиновой кожной пробы (Lyashchenko et al.,

2004). ИФА также может быть полезен для обнаружения M. bovis у диких животных. В Новой Зеландии ИФА утвержден в качестве дополнительного параллельного теста для выращиваемых на фермах оленей, который следует проводить через 13 – 33 дней после проведения кожной пробы на середине шеи (Griffin et al., 1994). Были разработаны и альтернативные форматы серотестов. Например, экспресс-тест бокового сдвига (ТВ StatPak) оказался эффективным для выявления больных туберкулезом животных, особенно среди некоторых домашних, диких (Lyashchenko et al., 2008) и зоопарковых животных, таких как южноамериканские верблюдовые, барсуки (Greenwald et al., 2003), среди нечеловекообразных приматов или слонов (Greenwald et al., 2009), для которых нет тестов на клеточный иммунитет (гамма-интерферонный анализ), а кожные пробы оказались ненадежными. Однако чувствительность для КРС остается относительно низкой. Тест в настоящее время лицензирован в США специалистами USDA для слонов и нечеловекообразных приматов и утвержден для барсуков в Соединенном Королевстве.