 |
1.3. Бактериология (культивирование)
|
|
|
|
Выделение МАР от животного гарантирует окончательный диагноз инфицирования этим организмом. Несмотря на то, что культивирование технически трудный и длительный процесс, оно является единственным тестом, который не продуцирует ложноположительных результатов (100% специфичность). Однако вследствие феномена потенциального переноса, теоретически возможно, что исследование фекальной культуры от неинфицированных животных в контаминированных объектах может привести к ложноположительным результатам (Nielsen & Toft, 2008).
Культивирование в фекалиях - это наилучший тест для диагностики паратуберкулеза у живых животных (больных животных). В действительности этот метод культивирования в фекалиях позволяет выявлять большинство животных на продвинутых стадиях болезни, но идентифицирует небольшое количество животных на ранних стадиях инфекции (Nielsen & Toft, 2008). В зависимости от условий, чувствительность фекальной культуры составляет 70% для больного КРС, 74% для инфекционного КРС и 23 – 29% для инфицированного КРС. Культивирование тканей от КРС, овец и коз на МАР является более чувствительным, чем гистопатологическое исследование (Fodstad & Gunnarsson, 1979; Koh et al., 1988; Whittington et al., 1999).
Существует несколько методов культивирования, которые варьируют в зависимости от среды и протоколов обработки пробы. Культивирование МАР всегда проводится с помощью специальной среды, обогащенной микобактином J, который является коммерчески доступным.
Организмы MАР значительно уступают в численности другим бактериям или грибам в образцах фекалий и кишечных тканей. Успешное выделение МАР из таких проб зависит от эффективной инактивации этих нежелательных организмов. Оптимальный метод деконтаминации должен иметь минимальный тормозящий эффект на рост МАР. Было продемонстрировано, что протоколы рутинной деконтаминации уменьшают количество организмов МАР, выделенных из пробы, на приблизительно 2, 7 log10 и 3, 1 log10 для фекалий и тканей, соответственно.
|
|
|
Существуют два основных метода традиционного культивирования MАР: метод с использованием щавелевой кислоты и NaOH для деконтаминации и среды Lő wenstein-Jensen для выращивания, и метод с использованием хлорида гексадецил пиридиния (НРС) для деконтаминации в сочетании со средой Herrold из яичного желтка (HEYM) или Middlebrook 7H10, а также жидких сред, таких как Middlebrook 7H9 или коммерческих эквивалентов для выращивания. Несмотря на публикации о
том, что HEYM способствует росту изолятов МАР от КРС значительно лучше, чем LJ, недавние исследования продемонстрировали, что определенные штаммы растут лучше на средах LJ или Middlebrook. Преимущество среды 7Н10 заключается в том, что она лучше поддерживает рост овечьих штаммов по сравнению с HEYM. Жидкие среды, по сообщениям, являются более чувствительными, чем твердые среды, как в отношении овечьих штаммов, так и в отношении штаммов КРС.
Первичные колонии МАР на твердых питательных средах могут появиться в любое время в период от 5 недель до 6 месяцев после заражения. Овечьи штаммы, включая необычные ярко-жёлтые пигментированные типы, растут хуже, чем штаммы КРС на обычно используемых средах, таких как HEYM или LJ, а первичные культуры нельзя отбраковывать как отрицательные без продолжительной инкубации. Твердая питательная среда Middlebrook 7H10, обогащенная яичным желтком и микобактином, отлично подходит для культивирования овечьих штаммов МАР (Whittington et al., 1999).
Первичные колонии штамма КРС МАР на среде HEYM это очень маленькие, полусферические, мягкие, немукоидные и первоначально бесцветные и прозрачные. Размер колонии сначала очень незначителен. Он может оставаться 0, 25-1 мм в размере, с тенденцией к отсутствию роста, при этом колонии будут многочисленны на скошенном агаре. Границы колонии круглые и ровные, а их поверхности гладкие и блестящие. По мере продолжения инкубации колонии становятся больше, более выпуклыми, непрозрачными, от грязно белого до светло-коричневого или бежевого цвета. Более старые изолированные колонии могут достигать 2 мм. Морфология колоний со временем меняется с гладкой на шероховатую и с полусферической на имеющую округлые выступы.
|
|
|
На модифицированной среде 7Н10 колонии штамма КРС менее выпуклые, чем на HEYM, особенно на старых культурах. Они малы в размере, приблизительно до 1 мм в диаметре и, будучи светло-коричневого цвета, немного светлее среды. По сравнению с колониями штаммов КРС на HEYM, колонии на 7Н10 труднее для выявления. Колонии овечьего штамма МАР на модифицированной 7Н10 выпуклые, мягкие, влажные, блестящие, от грязно белого до светло-коричневого цвета и очень схожи с цветом среды. Колонии типично очень незначительны в размере от булавочной головки до 0, 5 мм, но могут достигать 1 мм и редко 1, 5 мм, если на скошенном агаре возникает несколько колоний.
Сапрофитные микобактерии могут иметь схожий внешний вид на любой среде, но часто заметны через 5 – 7 дней.
Для идентификации МАР небольшое количество инокулума подозрительных колоний следует субкультивировать на той же среде с микобактином и без него с целью демонстрации зависимости от микобактина. Микобактин присутствует в клеточной стенке организма, и большое количество инокулума может содержать достаточно микобактина для содействия росту МАР на среде, которая не содержит микобактина. Кроме того, следует применять подтверждение в ПЦР (нацелена на IS900 или F57) для идентификации изолятов МАР.
Примерами подходящих сред могут служить:
i i) Среда Herrold из яичного желтка с микобактином
На 1 литр среды: 9 г пептона; 4, 5 г хлорида натрия; 2, 7 г экстракта говядины; 27 мл глицерина; 4, 1 г пирувата натрия; 15, 3 г агара; 2 мг микобактина; 870 мл дистиллированной воды; шесть яичных желтков (120 мл) и 5, 1 мл 2% водного раствора малахита зелёного. Взвесить первые шесть ингредиентов и растворить в дистиллированной воде при подогревании. Довести рН жидкой среды до 6, 9-7, 0 с помощью 4% NaOH и протестировать с тем, чтобы удостовериться, что рН твёрдой фазы составляет 7, 2-7, 3. Добавить микобактин, разведённый в 4 мл этилового спирта. Автоклавировать при 121º С в течение 25 минут. Охладить до 56º С и асептическим способом добавить шесть стерильных яичных желтков3 и стерильный раствор малахита зелёного. Осторожно перемешать и распределить по стерильным пробиркам.
|
|
|
3 Используйте свежие яйца, которые были снесены не более чем за 2 дня до этого, из стада, не получавшего антибиотики. С помощью щётки промойте яйца водой, содержащей моющее средство. Ополосните водой и поместите яйца в 70º спирт на 30 минут. Высушите, поместив их между двумя стерильными полотенцами. С помощью пинцета Адсона (крысиный зуб) разбейте один конец яичной скорлупы, сделав отверстие приблизительно 10 мм, и удалите белок, используя пинцет и силу тяжести. Сделайте отверстие больше и нарушьте целостность желтка. Перемешайте яичный желток путём вращения пинцета и удалите яичный мешок. Вылейте перемешанный яичный желток в среду. )
Разрешается добавлять 50 мг хлорамфеникола, 100 000 Е пенициллина и 50 мг амфотерицина В.
i ii) Модифицированная среда Dubos
На 1 литр среды: 2, 5 г казаминовых кислот; 0, 3 г аспарагина; 2, 5 г безводного динатрий водород фосфата; 1 г калий диводород фосфата; 1, 5 г цитрата натрия; 0, 6 г кристаллического сульфата магния; 25 мл глицерина; 50 мл 1% раствора Твин 80 и 15 г агара. Растворить каждую соль в дистиллированной воде при минимальном подогреве и довести раствор до 800 мл. Добавить микобактин в спиртовом растворе при 0, 05% (2 мг растворить в 4 мл этилового спирта), нагреть среду до 100º С свободно проходящим паром, а затем стерилизовать автоклавированием при 115º С в течение 15 минут. Охладить до 56º С на водяной бане, добавить антибиотики (100 000 Е пенициллина; 50 мг хлорамфеникола и 50 мг амфотерицина В) и сыворотку (200 мл бычьей сыворотки, простерилизованной фильтрацией через прокладку Seitz “EX” и инактивированной термическим образом при 56º С в течение 1 часа). Среду тщательно перемешать, а затем распределить по стерильным пробиркам. Преимуществом данной среды является то, что она прозрачная, а это облегчает раннее обнаружение колоний.
|
|
|
i iii) Модифицированная среда Middlebrook 7Н10 и 7Н9 1. 3. 2. Приготовление пробы
ii
Можно использовать среды Middlebrook с добавлением микобактина и различными коммерчески доступными добавками. Дополнительные консультации по составу можно получить в Справочных лабораториях МЭБ.
iv) Среда Lő wenstein-Jensen c микобактином или без него.
i i) Обработка образцов ткани
Не следует использовать химические консерванты. Ткани можно замораживать при –20º С.
Во избежание контаминации фекалии следует перед отправкой в лабораторию отмывать от частичек тканей кишечного тракта.
� a) Метод расщепления/осаждения для деконтаминации тканей
Приблизительно 4 г слизистой из подвздошно-слепокишечного клапана или 4 г брыжеечного узла поместить в стерильный сосуд смесителя, содержащий 50 мл трипсина (2, 5%). Смесь нейтрализовать с использованием 4% NaOH и рН бумаги и перемешивать в течение 30 минут при комнатной температуре с помощью магнитной мешалки. Расщеплённую смесь фильтровать через марлю. Фильтрат центрифугировать приблизительно при 2000-3000 g в течение 30 минут. Надосадочную жидкость слить и выбросить. Осадок ресуспендировать в 20 мл 0, 75 % НРС и дать отстояться, не трогая, в течение 18 часов при комнатной температуре. Частицы, которые осаждаются на дно пробирки, следует использовать в качестве инокулума и удалить пипеткой, не затрагивая надосадочную жидкость. В качестве альтернативы можно использовать другие методы деконтаминации, как например обработка 5% щавелевой кислотой.
� b) Метод двойной инкубации для деконтаминации тканей
Около 2 г пробы ткани (очищенной от жира) нарезать тонко, используя стерильное лезвие скальпеля или ножницы, и гомогенизировать в течение 1 минуты в 25 мл 0, 75% НРС. Позволить пробе отстояться, чтобы пена и крупные кусочки ткани выпали в осадок. Вылить гомогенат ткани в центрифужную пробирку с осторожностью, чтобы в нее не попал жир и крупные кусочки ткани. Дать отстояться в течение 30 минут, затем перенести 10 мл суспензии, взятой непосредственно над осадком, в 30 мл пробирку и инкубировать в течение 3 часов при 37º С. Центрифугировать в течение 30 минут при 900 g, удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать пеллету в 1 мл смеси антибиотиков, содержащей по 100 мкг ванкомицина, амфотерицина и налидиксовой кислоты (VAN). Инкубировать в течение ночи при 37 º С. Использовать суспензию для инокуляции среды, как описано выше.
|
|
|
� c) Инокуляция культуральных сред и инкубация
Приблизительно 0, 1 мл инокулума перенести на каждую из трёх скошенных питательных сред Herrold, содержащих микобактин, и на одну скошенную питательную среду Herrold без микобактина. Инокулум распределить равномерно по поверхности скошенных сред. Пробирки оставить в наклонном положении при 37º С приблизительно на неделю с незакрученными колпачками. Вернуть пробирки в вертикальное положение, когда со срезов выпарится свободная влага. Крышки завинтить, а пробирки поместить в корзинках в инкубатор на 37º С.
Яйцо в среде Herrold обеспечивает то количество фосфолипидов, которое достаточно для нейтрализации бактерицидной активности остаточного хлорида гексадецил пиридиния в инокулуме. Другие среды (модифицированные среды Dubos и Middlebrook) не обладают таким свойством. С целью деконтаминации образца можно использовать другие виды обработок, например, обработку 5% щавелевой кислотой.
Хлорид гексадецил пиридиния является относительно неэффективным средством для контроля роста контаминирующих грибов. Было обнаружено, что амфотерицин В (фунгизон) эффективно борется с чрезмерным ростом грибов в инокулированных средах. Фунгизон можно включать в среду Herrold в конечной концентрации 50 мкг на один мл среды. Из-за снижения антигрибковой активности хранение среды Herrold, содержащей фунгизон, следует ограничивать до 1 месяца при 4º С.
Скошенные питательные среды инкубируют в течение 15-20 недель и проводят еженедельное наблюдение, начиная с шестой недели.
i ii) Обработка фекальных образцов
Не следует использовать химические консерванты. Фекальные образцы можно замораживать при – 70º С.
� a) Суспендирование и деконтаминация фекалий
1 г фекалий перенести в 50 мл пробирку, содержащую 20 мл стерильной дистиллированной воды. Смесь встряхивать в течение 30 минут при комнатной температуре. Частицам более крупного размера позволить осесть в течение 30 минут. Пять мл самого верхнего слоя фекальной суспензии перенести в 50 мл пробирку, содержащую 20 мл хлорид гексадецил пиридиния. Пробирку несколько раз перевернуть с тем, чтобы добиться однородного распределения, и оставить постоять в спокойном состоянии в течение 18 часов при комнатной температуре.
� b) Инокуляция культуральных сред
0, 1 мл ненарушенного осадка перенести на каждую из четырёх скошенных питательных сред Herrold, три из которых с микобактином и одна без микобактина. С осадка можно снять мазок и окрасить с помощью метода Циля-Нильсена.
� c) Инкубирование и наблюдение за скошенными питательными средами 1. 4. ДНК-зонды и полимеразная цепная реакция
� 2. Серологические тесты
� 2. 1. Иммуноферментный анализ
� 2. 2. Реакция связывания комплемента
�
Используются те же самые процедуры, что и для образцов ткани.
Вариации вышеупомянутых методов были уже описаны (Collins et al., 1990; Merkal et al., 1968). Чувствительность культуры можно повысить применением жидких сред и центрифугированием, а не с помощью осаждения. Метод двойной инкубации, описанный Whitlock et al. (1991) помогает деконтаминировать инокулум и обеспечивает более высокую чувствительность, чем протоколы осаждения и фильтрации (Eamens et al., 2000). Метод двойной инкубации включает смешивание 2 г
фекалий с 15 мл физиологического раствора или воды, затем осаждение в течение 30 минут и перенос (избегая волокнистых веществ) 5 мл верхней части суспензии в 25 мл 0, 9% НРС в сердечно-мозговой экстракт 50% крепости. После инкубации при 37º С в течение 16 – 24 часов смесь центрифугируют при 900 g в течение 30 минут (при комнатной температуре), надосадочную жидкость удаляют и пеллету ресуспендируют в 1 мл VAN. Смесь инкубируют в течение 24 – 72 часов при 37º С и используют для инокуляции среды, как описано выше.
В настоящее время разрабатываются ДНК-зонды, позволяющие обнаруживать МАР в диагностических пробах и быстро идентифицировать бактериальные изоляты (Ellingson et al., 1998). Их использовали для различения МАР и других микобактерий.
McFadden et al. идентифицировали последовательность (McFadden et al., 1998), названную IS900, которая является инсерционной последовательностью, специфичной для МАР. Имели место сообщения о том, что небольшое число изолятов, но не МАР, продуцировали амплифицированные продукты того же размера, который ожидался от МАР. Расщепление с помощью фермента рестрикции можно использовать применительно к положительным IS900 продуктам для подтверждения того, что их последовательность совпадает с МАР.
Выявление новых последовательностей ДНК, считающихся уникальными для МАР (ISMav2, f57 и ISMap02), предоставляет дополнительную возможность для быстрой идентификации этого организма с помощью технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Stabel & Bannantine, 2005; Strommenger et al., 2001; Vansnick et al., 2004). Рестрикционный анализ IS1311, инсерционной последовательности общей для M. avium и МАР, можно использовать для различения между этими видами и для типирования штаммов МАР овец, КРС и бизонов (Sevilla et al., 2005; Whittington et al., 1998).
За последние годы широко разрабатывались методы ПЦР в реальном времени для выявления МАР в различных пробах (кровь, молоко, фекалии, ткани и образцы окружающей среды). Этот метод быстр и дает надежду на выявление прихотливых и медленно растущих микроорганизмов, таких как МАР. Однако этот молекулярный инструмент чрезвычайно зависит от качества проб нуклеиновой кислоты. Поэтому метод экстрагирования ДНК, который обеспечивает высококачественный образец ДНК и максимальное извлечение бактериальной ДНК, является важным шагом в использовании ПЦР в реальном времени (Parka et al., 2014).
Дальнейшие работы, которые охватывали усовершенствование методов ПЦР и экстрагирование ДНК, продемонстрировали, что этот метод может занять важное место в диагностике и контроле болезни Ионе у КРС (Leite et al., 2013).
Коммерческие диагностические ПЦР тесты для выявления МАР в пробах молока и фекалий доступны в продаже, но пользователи должны учитывать интерпретацию полученных данных и их пригодность своему назначению до применения.
К серологическим тестам, которые обычно применяются для диагностики паратуберкулеза у крупного рогатого скота, относятся реакция связывания комплемента
(РСК), твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунодиффузия в агаровом геле (AGID) (Sockett et al. , 1992). Международной сыворотки, которую можно использовать в качестве стандартной, не существует.
ИФА является в настоящее время наиболее чувствительным и специфичным тестом для обнаружения антител к МАР у КРС. Его чувствительность сравнима с чувствительностью РСК в клинических случаях, но выше, чем чувствительность РСК при тестировании субклинически инфицированных носителей. Специфичность ИФА повышается абсорбцией сывороток M. phlei. На основе абсорбирующего ИФА, разработанного Yokomizo et al. (1983, 1985) и модифицированного Milner et al. (1988), был создан коммерческий набор Cox et al. (1991).
ИФА выявляет около 30 – 40 % КРС, в отношении которого с помощью культивирования в фекалиях на твердых средах было установлено, что он инфицирован (Whitlock et al., 2000). Подобно методам культивирования, чувствительность ИФА зависит от уровня выделения МАР с фекалиями и возраста животных. Крупное исследование, проведенное в Австралии, продемонстрировало, что действительная чувствительность ИФА у 2-, 3- и 4-летних коров составляла 1, 2%, 8, 9% и 11, 6% соответственно, но оставались между 20 и 30% в более старших возрастных группах (Jubb et al., 2004). Было подсчитано, что общая действительная чувствительность для всех возрастных групп составляет 15% (Jubb et al., 2004, Whitlock et al., 2000). У КРС чувствительность ИФА находилась в диапазоне от 9 до 94%, а специфичность ИФА была 79 – 100% (Nielsen & Toft, 2008).
Абсорбирующий ИФА сочетает чувствительность ИФА с дополнительной специфичностью этапа абсорбции. Тестируемые сыворотки разводят буфером, содержащим растворимый антиген M. phlei, до того, как проводить непрямой ИФА. Эта процедура устраняет неспецифические перекрёстно реагирующие антитела. В ранних версиях сыворотки абсорбировались цельным возбудителем M. phlei, который перед тестированием выводился центрифугированием.
Был разработан формат титрационного микропланшета, при котором антиген МАР наносится на 96-луночные планшеты. Пробы разводят в разбавителе, содержащем M. phlei для удаления перекрёстно реагирующих антител. При инкубации разведённой пробы в сенсибилизированной лунке антитела, специфические для МАР, образуют комплекс с сенсибилизирующими антигенами. После отмывки с лунок несвязанных материалов добавляют меченый пероксидазой хрена антибычий иммуноглобулин. Он вступает в реакцию с иммуноглобулинами, прикреплёнными к твёрдофазному антигену. Уровень конверсии субстрата пропорционален количеству связанного иммуноглобулина. Последующее окрашивание, измеряемое (при длине волны соответствующей используемому хромогену) спектрофотометрическим способом, пропорционально количеству антител, присутствующих в опытной пробе.
Несколько тест-систем на основе абсорбирующего ИФА можно приобрести коммерческим путём. Сам метод и необходимые опытные материалы, интерпретация результатов и подсчёты полностью описаны в инструкциях, которые сопровождают коммерческий набор. Сообщалось о нескольких коммерчески доступных ИФА со схожей чувствительностью и специфичностью. Некоторые коммерческие наборы предлагают опцию тестирования проб молока. Было обнаружено, что ИФА на коровьем и овечьем молоке имеет специфичность, схожую с сывороточной ИФА, но
менее чувствительную, чем анализ крови (Hendrick et al., 2005; Salgado et al., 2005). У КРС чувствительность ИФА на молоке находится в диапазоне 21 – 61 %, а специфичность такого ИФА составляет 83 – 100% (Nielsen & Toft, 2008).
В течение многих лет РСК была стандартным тестом, используемым для крупного рогатого скота. РСК показывает хорошие результаты у клинически подозрительных животных, но не обладает достаточной специфичностью для применения в общей популяции с целью контроля. Тем не менее, часто спрос на неё поступает из стран, импортирующих крупный рогатый скот. Целый ряд процедур РСК используется на международном уровне. Примером микротитрационного метода для проведения РСК может служить следующее:
|
|
|
