 |
2.1.1. Процедура исследования. 3. Исследования на наличие клеточно-опосредованного иммунитета 3.1. Гамма-интерфероновый анализ
|
|
|
|
2. 1. 1. Процедура исследования
i i) Антиген представлен в виде водного экстракта бактерий, из которых удалён липид (штамм M. paratuberculosis 316F). Можно также использовать Mycobacterium avium D9.
i ii) Все сыворотки инактивировать на водяной бане при 60º С в течение 30 минут и развести в соотношении 1/4, 1/8 и 1/16. На каждом планшете должна быть положительная контрольная сыворотка и отрицательная контрольная сыворотка. Приготовить также следующие контроли: контроль антигена, контроль комплемента и контроль гемолитической системы.
i iii) Восстановленный лиофилизированный комплемент развести до такой степени, чтобы он содержал шестикратную Н50 (50% гемолизирующую дозу), вычисленную титрованием по отношению к антигену.
i iv) Овечьи эритроциты, 2, 5%, сенсибилизировать 2 единицами Н100 гемолизина.
i v) Все разведения и реактивы готовить в кальций/магний вероналовом буфере; 25 мкл каждого реактива перенести на 96-луночные титрационные микропланшеты с круглым дном.
i vi) Первичное инкубирование проводить при 4º С в течение ночи и вторичное инкубирование проводить при 37º С в течение 30 минут.
i vii) Считывание и интерпретация результатов: Планшеты можно оставить постоять с тем, чтобы выпал осадок, или центрифугировать и считывать результаты следующим образом: 4+ = 100% фиксация, 3+ = 75% фиксация, 2+ = 50% фиксация, 1+ = 25% фиксация и 0 = полный гемолиз. Титр опытных сывороток выражается как обратное значение наивысшего разведения сыворотки, дающего 50% фиксацию. Реакция 2+ при 1/8 считается положительной. Результаты должны интерпретироваться в соответствии с клиническими признаками и другими лабораторными результатами. 2. 3. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле
|
|
|
ii
Реакция иммунодиффузии в агаровом геле (AGID) применима для подтверждения болезни у подозрительного с клинической точки зрения крупного рогатого скота,
овец и коз. Сообщалось, что у МРС в Новой Зеландии и Австралии AGID обеспечивает немного более высокую специфичность и чувствительность, чем получаемые при применении ИФА (Gwozdz et al. , 2000; Hope et al., 2000; Sergeant et al. , 2003). Опубликованная специфичность и чувствительность AGID, подсчитываемая по гистологическим результатам, составляла 99 – 100% (95% доверительный интервал) и 38 – 56% (95% доверительный интервал) соответственно (Hope et al., 2000).
Антиген, который используют в неочищенном протоплазматическом экстракте лабораторного штамма M. avium 18 (официально МАР 18), готовят путём разрушения клеток в аппарате для фракционирования с гидравлическим прессом. Разрушенные клетки центрифугируют при 40 000 g в течение 2 часов с целью выведения дебриса клеточной стенки, а фракцию надосадочной жидкости сохраняют и лиофилизируют. Этот антиген повторно суспендируют в воде в концентрации 10 мг/мл.
Агарозу растворяют в барбиталовом буфере, рН 8, 6, содержащем азид натрия, до конечной концентрации агарозы 0, 75%. Агарозу можно вылить в чашки Петри или на стеклянные предметные стёкла. Лунки нарезают в шестиугольной конфигурации. Диаметр лунок 4 мм, расстояние между лунками 4 мм, а высота агара должна составлять 3 – 4 мм. В центральные лунки добавляют антиген. В периферические лунки перемежающимся образом добавляют опытные, положительные и отрицательные сыворотки.
Планшеты инкубируют во влажной камере при комнатной температуре. Через 24 и 48 часов инкубации гели исследуют на наличие преципитационных линий. Появление через 48 часов или ранее одной или более чётко очерченных преципитационных линий, демонстрирующих идентичность с линиями контрольной положительной сыворотки, свидетельствует о положительном результате теста. Отсутствие каких-либо преципитационных линий свидетельствует об отрицательном результате теста. Могут иметь место неспецифические линии.
|
|
|
Используются несколько вариаций этого теста.
3. Исследования на наличие клеточно-опосредованного иммунитета 3. 1. Гамма-интерфероновый анализ
Выявление клеточно-опосредованного иммунного ответа предшествует выявляемой выработке антител. Животные, которые инфицированы минимально, часто не демонстрируют реакции при серологическом тестировании, но могут демонстрировать положительную реакцию в тестах, которые измеряют клеточный иммунитет. В инфицированных популяциях ожидается, что более высокое количество животных будет реагировать в исследованиях на клеточно-опосредованный иммунитет по сравнению с исследованиями на антитела, так как клеточно-опосредованный иммунитет указывает на подвергание воздействию инфекции, в то время как антитела указывают на прогресс инфекции.
Анализ базируется на высвобождении гамма-интерферона из сенсибилизированных лимфоцитов в течение 18-36-часового периода инкубации со специфическим антигеном (очищенный белковый дериват птичьего туберкулина, очищенный
белковый дериват бычьего туберкулина или джонин4). Количественное обнаружение бычьего гамма-интерферона производится с помощью сэндвич-варианта ИФА, который использует два моноклональных антитела к бычьему гамма-интерферону. Был разработан коммерческий диагностический тест, основанный на обнаружении гамма-интерферона, для диагностики туберкулеза КРС. Метод и необходимые опытные материалы, интерпретация результатов и вычисления полностью описаны в инструкциях, прилагаемых к коммерческому набору. Этот тест еще не был валидирован производителем для диагностики паратуберкулеза. Фактически результаты, полученные исходя из этого анализа, часто трудно интерпретировать, так как отсутствует согласованность в отношении критериев и типов интерпретации и количества антигенов, используемых для стимулирования лимфоцитов крови. У КРС по имеющимся данным специфичность теста варьировалась от 94% до 67%, чувствительность находилась в пределах 13 – 85% в зависимости от критериев интерпретации (Kalis et al., 2003; Nielsen & Toft, 2008).
4 Джонин можно купить в ID-Lelystad, Нидерланды.
5 Например: BioSource, Nivelles, Бельгия; ID vet Montpellier, Франция
|
|
|
