 |
50)ИФА(конкурентный способ)-опр-ие АГ гепатита В
|
|
|
|
48)РТГА
Эта реакция применяется в вирусологической практике:
- для определения типа вируса (на стекле);
- для обнаружения в сыворотке больных (развернутая).
При постановке ориентировочной реакции торможения гемагглютинации на стекло наносят по 1 капле типоспецифических иммунных сывороток, затем добавляют по 1 капле испытуемого материала и 1 капле 5% взвеси эритроцитов.
Учет результатов: тип вируса определяют по той сыворотке, с которой реакция не произошла, так как иммунная сыворотка, специфическая для выделенного вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность, и эритроциты не агглютинируются.
49)РИФ
В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционатфлюорисцеина и др. ).
Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний — для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.
Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.
Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др. );
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченойантисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию — свечение.
Компоненты непрямой РИФ:
1) исследуемый материал;
2) специфическая антисыворотка;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;
4) Изотонический раствор хлорида натрия.
|
|
|
Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем — меченой антиглобулиновой сывороткой.
Светящиеся комплексы АГ-АТ — меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.
Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ — меченые — АТ-комплемент.
Реакция относится к серологическим реакциям с участием меченых антигенов или антител.
Проводится прямым и непрямым методами.
При прямом методе обнаруживают антиген в материале от больного. Используется диагностическая флюоресцирующая сыворотка, которая содержит иммуноглобулины, выделенные из иммунных сывороток и меченные флюорохромами.
Специфический антиген обнаруживается в виде ярко-зеленых люминесцирующих конгломератов, а фон препарата окрашивается в оранжево-красный цвет.
Компоненты реакции прямой иммунофлюоресценции:
Для поиска антигена при экспресс-диагностике:
1) исследуемый материал;
2) специфическая люминесцентная сыворотка;
3) люминесцентный микроскоп.
При диагностике гриппа проводят дифференциацию от возбудителей парагриппа и аденовирусной инфекции. Носоглоточный мазок обрабатывают флюоресцирующей гриппозной сывороткой или гриппозным иммуноглобулином.
«+» результат в виде зеленого свечения получают через 3 часа.
При непрямом методе проводят обнаружение и титрование специфических антител. Титром сыворотки называется ее максимальное разведение, при котором отмечается флюоресценция на «+ +».
|
|
|
Компоненты реакции непрямой иммунофлюоресценции
Для поиска антигена при экспресс-диагностике:
1) исследуемый материал (антиген);
2) специфическая сыворотка;
3) антиглобулиновая люминесцентная сыворотка
4) люминесцентный микроскоп.
/ фаза специфическая
Сывороточные антитела адсорбируются на антигене.
// фаза неспецифическая
Используется антиглобулиновая сыворотка с антителами, меченными флюорохромами. Образуется комплекс антиген+антитело (I) + антиглобулиновая сыворотка (II), который светится.
50)ИФА(конкурентный способ)-опр-ие АГ гепатита В
Конкурентный тип.
Назначение.
Предназначена для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (НВз Ад) в сыворотках и плазме крови при диагностике вирусного гепатита В и определения носительства НВ5 Ад.
Компоненты:
1) исследуемый материал сыворотка или плазма крови;
2) антитела к НВз Ад, адсорбированные на поверхности лунки полистироловогомикропланшета;
3) коньюгат — мышиные моноклониальные антитела к НВз Ад, меченые пероксидазой,
4) ортофенилендиамин (ОФД) -субстрат;
5) фосфатно-солевой буфер;
6) контрольные сыворотки:
— положительная (сыворотка с НВе Ад);
— отрицательная (сыворотка без НВз Ад). Ход работы
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.
2) Инкубация 1 час при 37 «С.
3) Отмывание лунок.
4) Внесение конъюгата.
5) Инкубация 1 час при 37 «С.
6) Отмывание лунок.
7) Внесение ОФД. При наличии НВз Ад раствор а лунках желтеет.
Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых НВз Ад.
Механизм
Реакция протекает в три фазы:
1) НВз Ад исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (НВз Ад — агл\ НВз АТ).
2) Антитела НВз Ад, меченые пероксидазой, связываются с оставшимися свободными детерминантами НВз Ад комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ {ап! 1 НВз АТ-НВз Ад-ап(1 НВз АТ, меченые пероксидазой).
3) ОФД взаимодействуют (с пероксидазой) комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.
Непрямой тип
Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ-инфекции.
|
|
|
Цель: серологическая диагностика ВИЧ-инфекции — обнаружение антител к антигенам ВИЧ, Компоненты:
1) исследуемый материал — сыворотка крови;
2) синтетические пептиды, имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: др 120 и др 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;
3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТкАТ-м);
4) ОФД;
5) фосфатно-солевой буфер;
6) контрольные сыворотки:
- положительная;
- отрицательная.
Ход работы
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток. 2} Инкубация 30 минут при 37 «С.
3) Отмывание.
4) Внесение антиглобулиновой сыворотки, меченой ферментом.
5) Инкубация 30 минут при 37 «С.
6) Отмывание.
7) Внесение ОФД. Механизм
Реакция протекает в 3 фазы:
1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (др 120 и др 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ {АТ к ВИЧ — АГ ВИЧ).
2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т. к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.
3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.
|
|
|
