51)ИФА(непрямой способ)-д. СПИДа

51)ИФА(непрямой способ)-д. СПИДа

При ИФА в качестве метки применяют ферменты.

Непрямой тип
Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ-инфекции.
Цель: серологическая диагностика ВИЧ-инфекции — обнаружение антител к антигенам ВИЧ, Компоненты:
1) исследуемый материал — сыворотка крови;
2) синтетические пептиды, имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: др 120 и др 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;
3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТкАТ-м);
4) ОФД;
5) фосфатно-солевой буфер;
6) контрольные сыворотки:
- положительная;
- отрицательная.
Ход работы
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток. 2} Инкубация 30 минут при 37 «С.
3) Отмывание.
4) Внесение антиглобулиновой сыворотки, меченой ферментом.
5) Инкубация 30 минут при 37 «С.
6) Отмывание.
7) Внесение ОФД. Механизм

Реакция протекает в 3 фазы:
1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (др 120 и др 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ {АТ к ВИЧ — АГ ВИЧ).
2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т. к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.
3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.

52)Серологическая диагностика Вич, с помощью реакции иммуноблотинга

Разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ Ыо* — промокать, пягно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления спектра антител к антигенным смесям Относится к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.

Принцип метода на примере выявления антител к ВИЧ Реакция проводится в несколько этапов:
1) Антигены, экстрагированные из исследуемого объекта — ВИЧ (белки-р гликопротеины-др), подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле — разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.
2) Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной, и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигена.
Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге Мембрану разрезают на полоски (стрипы).
3) Стрип с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.
4) Сгрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают.
5) Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют зоне локализации комплекса АГ-АТ.