 |
Хроматографические методы фармакогностического анализа
|
|
|
|
Хроматографические методы получили широкое распростране-ние в фитохимии благодаря эффективности, простоте эксперимента, селек-тивности, экспрессности, возможности автоматизации и сочетания с други-ми физико-химическими методами. Особенностью хроматографических ме-тодов является универсальность, т. е. возможность использовать их для разделения и идентификации твердых, жидких и газообразных природных соединений. Особая ценность заключается в возможности эффективно разде-лять соединения с близкими свойствами, проводить не только качествен-ный, но и количественный анализ исследуемых объектов.
При классификации хроматографических методов учитывают природу подвижной и неподвижной фаз, механизм взаимодействия между фазой и разделяемыми веществами, технику эксперимента (табл. 9).
Т а б л и ц а 9
Классификация хроматографических методов
Бумажная хроматография (БХ). В распределительной хроматографии набумаге разделение веществ происходит вследствие различия в распределении между двумя жидкими фазами, одна из которых подвижна (как правило, это смесь органических растворителей), а другая — неподвижна и представляет
| Фармакогностические методы анализа | 2 3 | |
собой воду, находящуюся в волокнах хроматографической бумаги. Перед хро-матографированием растворы анализируемых веществ наносят на бумагу.
Принципы и применение методов тонкослойной, газовой и жидкостной хроматографии в фармацевтическом анализе описаны в Государственной фармакопее Украины.
Тонкослойная хроматография (ТСХ). В тонкослойной хроматографииадсорбентом служит тонкий, равномерный слой (обычно толщиной около 0, 24 мм) сухого мелкоизмельченного материала, нанесенного на стеклян-ную пластинку, алюминиевую фольгу или пластмассовую пленку. Подвиж-ная фаза движется по поверхности пластинки под действием капиллярных сил. Хроматографический процесс зависит от адсорбента, его обработки
|
|
|
и природы используемых растворителей. Во время хроматографирования плас-тинка находится в хроматографической камере (чаще всего изготовленной из стекла, чтобы можно было наблюдать движение подвижной фазы по плас-тинке), которая обычно насыщена парами растворителя. В качестве твердого носителя используют силикагель, кизельгур, окись алюминия, целлюлозу или ионообменную смолу. Тонкий слой можно пропитать буферными мате-риалами, чтобы получить кислый, нейтральный или основный слой. Перед использованием пластинки могут быть активированы посредством нагрева-
ния в термостате при температуре от 100 до 105 °С в течение 1 ч. Методика вертикального и горизонтального элюирования изложены в ГФУ (раздел 2. 2. 27)
Широкий диапазон различных слоев в сочетании с многообразием сис-тем растворителей дает почти неограниченную возможность изменять силу разделения веществ. Это делает тонкослойную хроматографию незаменимой в анализе растительного сырья и препаратов из него. Метод ТСХ эффекти-вен, легок в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования.
В испытаниях на подлинность ТСХ служит для сравнения поведения при-родных соединений в анализируемом ЛРС и стандартного образца, обычно аутентичного одному из действующих веществ в экстракте. Если оба вещества продвигаются во время хроматографического процесса на одинаковое рас-стояние и если оба вещества, смешанные и подвергнутые хроматографиро-ванию, движутся как единое вещество, можно предположить, что эти веще-ства идентичны. Это предположение может быть подтверждено повторением той же процедуры с использованием другой хроматографической системы. Если два вещества ведут себя идентично в трех совершенно различных систе-мах, предположение об их идентичности вполне обосновано.
|
|
|
Величина удерживания Rf является основной характеристикой разделения веществ, которая используется для установления подлинности. Она показы-вает положение зоны вещества на хроматографической пластинке (рис. 2).
На полученной хроматограмме отношение расстояния, пройденного на адсорбенте данным веществом, к расстоянию, пройденному передним кра-ем («фронтом») подвижной фазы, есть величина Rf, характерная для данного вещества в данной хроматографической системе. Отношение расстояний, пройденных испытуемым веществом и стандартным образцом, принимают за величину Rr.
Величину удерживания Rf рассчитывают по следующей формуле:
b
Rf = —a,
где a — расстояние от линии старта до линии фронта, пройденного системой растворителей, мм;
b — расстояние от линии старта до верхнего края пятна, мм;
|
|
| a — расстояние, пройденное фронтом ра-створителей, мм; b — расстояние, пройден-ное идентифицируемым веществом, мм; c — расстояние, пройденное стандартным веществом, мм |
2 4 Введение
c — расстояние от линии старта до верх-него края пятна стандартного образца, мм.
На практике величины Rf могут значи-тельно варьировать в зависимости от конк-ретных экспериментальных условий. Надеж-ные результаты дает сравнение с аутентич-ным образцом, как описано выше, и именно эта методика используется для фармакопей-ных целей.
Для количественных измерений пятно мож-но удалить с пластинки, элюируя вещество подходящим растворителем, а затем опреде-лить его достаточно чувствительным методом, например спектрофотометрически (непосред-ственно либо после химической реакции).
| В некоторых случаях количественную оценку | |||||||
| можно провести путем измерения интенсив- | |||||||
| ности пятна с помощью сканирующего ден-
| |||||||
| ситометра и последующего сравнения этой | |||||||
| интенсивности | с | интенсивностями | пятен | ||||
| стандартных образцов. Методы разделения | |||||||
| с применением ТСХ иногда могут быть усо- | |||||||
| Рис. 2. Схема хроматограммы: | вершенствованы | путем многократного хро- | |||||
| А — извлечение; | матографирования | (хроматограмме | дают | ||||
В — стандартный образец;
высохнуть и вновь хроматографируют в той же системе), непрерывного хроматографи-рования (подвижная фаза непрерывно испа-ряется с верхнего края поверхности адсор-бента) или двухмерного хроматографиро-
вания (хроматограмме дают высохнуть, поворачивают под прямым углом
и вновь хроматографируют, часто в иной системе растворителей, чем перво-начально).
Проявляющие, или хромогенные реактивы. Для определения положения не-окрашенного вещества на полученной хроматограмме обычно необходимо обрабатывать хроматограмму реактивом, который либо обугливает разделен-ные вещества, либо переводит их в окрашенные или флуоресцирующие про-изводные. Проявляющие реактивы для обнаружения разделенных веществ на-носят на пластинку посредством опрыскивания, обработки парами или по-гружения. Часто применяют и другой удобный метод: проводят хроматографию на пластинке, пропитанной веществом, сильно флуоресцирующим под воз-действием коротковолнового ультрафиолетового света. Площади на пластин-ке, занятые веществами, поглощающими при той же длине волны, выглядят как темные пятна на флуоресцирующем фоне.
Хроматографическая камера представляет собой емкость с пришлифо-ванной крышкой для обеспечения герметичности и с плоским дном или дном с двумя желобами из инертного прозрачного материала, соответствую-щими по размеру используемым полоскам бумаги или пластинкам. Для гори-зонтального элюирования хроматографическая камера имеет желоб для по-движной фазы и дополнительно содержит устройство для подачи подвижной фазы к неподвижной фазе.
|
|
|
Если нет других указаний, работу проводят в насыщенной камере. Для достижения таких условий стенки камеры выстилают фильтровальной бума-
| Фармакогностические методы анализа | 2 5 | |
гой и вливают количество подвижной фазы, достаточное для насыщения фильтровальной бумаги и образования слоя глубиной около 5 мм. Закрывают камеру и оставляют стоять не менее чем 1 ч при комнатной температуре.
Хроматографическая камера должна быть защищена от действия света, если предполагается, что исследуемые соединения могут быть светочувстви-тельными. В любом случае камеру защищают от прямых солнечных лучей, чтобы на пластинке не образовались области повышенной температуры и не нарушалось правильное перемещение подвижной фазы.
Вертикальное элюирование. Если нет других указаний в частной статье, хроматографическое разделение выполняют восходящим способом в насы-щенной атмосфере. Предпочтительно использовать такие подвижные фазы (системы), которые обеспечивают величины Rf в пределах от 0, 3 до 0, 7.
Методика. Наносят объем раствора, указанный в частной статье, в виде компактного пятна диаметром не более 4 мм либо в виде полосы (длиной от 5—10 и высотой от 1 до 2 мм). Для нанесения используют микропипет-ку, микрошприц или калиброванный капилляр. Пятно должно находиться на расстоянии около 1, 5 см от нижнего края и отстоять не менее чем на 2 см от вертикальной стороны пластинки. Если на одной пластинке полу-чают несколько хроматограмм, пятна следует располагать на расстоянии не менее 1, 5 см друг от друга на линии старта, параллельной нижнему краю бумаги или пластинки. Когда растворитель испарится, пластинку по-мещают в камеру, стараясь установить ее как можно точнее в вертикаль-ном положении; стартовые точки должны находиться выше уровня под-вижной фазы. Камеру закрывают и выдерживают при постоянной темпе-ратуре. Дают подвижной фазе подняться на предписанное расстояние, обычно на 10—15 см, вынимают пластинку, отмечают положение фронта растворителя, высушивают и обнаруживают пятна способом, указанным в частной статье.
Горизонтальное элюирование. Растворы анализируемых веществ наносят на хроматографическую пластинку. После испарения растворителей из нане-сенных проб в желоб хроматографической камеры вводят с помощью шпри-ца или пипетки достаточное количество подвижной фазы, помещают плас-тинку в камеру горизонтально и подсоединяют устройство для подачи под-вижной фазы в соответствии с инструкцией производителя. Если указано
|
|
|
в частной статье, пластинку элюируют, начиная одновременно с двух кон-цов. Камеру закрывают и проводят хроматографирование при температуре от 20 до 25 °С. После того как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное
в частной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна ука-занным способом.
Исследование и интерпретация хроматограмм. Хроматограммы изучают визуально в дневном и УФ-свете. Отмечают границы и окраску пятен. Изме-ряют и записывают расстояние от линии старта до верхней границы каждого пятна. Если указано в частной статье, то опрыскивают хроматограмму соот-ветствующим реактивом. Основное пятно на хроматограмме, полученной для испытуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном на хроматограмме, полученной для раствора стандартного образца, сравнивая окраску (флюоресценцию в УФ-свете), размер и величину удерживания (Rf ) обоих пятен.
Проверка чувствительности. Чувствительность считается удовлетворитель-ной, если пятно или полоса четко обнаруживается на хроматограмме, полу-ченной с наиболее разбавленным раствором сравнения.
2 6 Введение
Проверка пригодности хроматографической системы. Хроматографическая система считается пригодной, если:
— на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки пригодности хроматографической системы, четко выделяются пятна указан-ных в частной статье веществ;
— величина Rf основного пятна на хроматограмме испытуемого раствора должна быть около величины, указанной в частной статье;
— на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки чувствительности хроматографической системы, пятно вещества должно быть видно четко.
|
|
|
