 |
Контрольные вопросы. Микроскопический анализ ЛРС
|
|
|
|
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Дайте определение науки фармакогнозии.
2. Сформулируйте цели и задачи фармакогнозии.
3. Что такое лекарственное растительное сырье?
4. По каким критериям устанавливают качество сырья?
5. Перечислите типы стандартов.
6. Какой фармакопеей пользуются для анализа ЛРС в Украине?
7. Что такое АНД? Назовите ее основные разделы на лекарственное растительное сырье.
8. Что такое подлинность ЛРС?
9. Что такое доброкачественность ЛРС?
10. Какова цель макроскопического анализа?
11. Почему исследование лекарственного сырья должно начинаться
с макроскопического анализа?
12. Как подготовить образец сырья к макроскопическому анализу?
13. Как определить размеры, запах и вкус сырья?
14. Дайте определение морфологической группы ЛРС «листья» (цветки, трава, кора, плоды, семена, подземные органы) как лекарственно-го растительного сырья.
Микроскопический анализ ЛРС
Необходимость в микроскопическом и микрохимическом ис-следовании возникает при анализе резаного, порошкованного, прессован-ного, гранулированного лекарственного растительного сырья, а также при необходимости отличить ЛРС от возможных примесей, внешний вид которых сходен с официнальным сырьем.
Разделы «Микроскопия» в фармакопейных статьях ГФ ХI содержат мик-роскопическую характеристику как цельного ЛРС, так и растительного по-рошка без указания степени измельчения. Частные монографии Европейской фармакопеи предусматривают микроскопический анализ крупного порошка ЛРС, проходящего сквозь сито 355.
Микроскопический анализ не может быть окончательным критерием иден-тификации растительного сырья. Только в совокупности с другими методами анализа (макроскопическим, химическим, хроматографическим, люминес-центным) можно достоверно установить подлинность объекта исследования.
|
|
|
Оборудование, материалы. Для проведения микроскопического анализатребуется ряд оптических приборов и вспомогательных инструментов. Основ-ные из них: микроскоп, лупа, поляроиды, объективный и окулярный мик-рометры. Для приготовления срезов сырья используют набор ботанических инструментов. Чаще всего это бритва и в особых случаях, если требуется по-лучить серию очень тонких срезов, — микротом. Универсальными в настоящее время являются салазочные микротомы, которые отличаются принципом работы устройства, подающего объект к ножу. Основными частями салазоч-ного микротома являются нож, закрепленный в держателе «салазок», и объек-тодержатель с устройством, поднимающим его на определенную высоту.
Реактивы для микроскопического исследования можно разделить на две группы: 1) включающие (индифферентные) и просветляющие и 2) реакти-вы для микрохимических реакций. В качестве включающих и просветляющих жидкостей используют воду, глицерин, смесь глицерин—вода (1: 2), 5 %-ный
| Микроскопический анализ ЛРС | 3 1 | |
раствор хлоралгидрата, водный раствор щелочей, раствор перекиси водоро-да. Состав реактивов для микрохимических реакций приведен на с. 35—37.
Микропрепараты, приготовленные с помощью различной техники, по-мещают на предметное стекло с нанесенной включающей жидкостью и на-крывают покровным стеклом.
Подготовка образца для микроскопического анализа. Анализ измель-ченного сырья начинают с внешнего осмотра, который проводят на сухом материале визуально или с помощью лупы × 10, желательно при дневном освещении. Отмечают цвет, опушенность, наличие каких-либо дополнитель-ных признаков, проверяют запах при растирании кусочков сырья между паль-цами, определяют морфологическую группу ЛРС.
|
|
|
Сухое растительное сырье перед работой следует размягчить. С учетом осо-бенностей объекта применяют холодное размачивание, кипячение, размяг-чение в водных парах во влажной камере и другие.
Холодное размачивание. Самый распространенный способ размягчения сырья, рекомендуемый для всех органов растения. Исследуемое сухое сырье помещают в колбу со смесью вода—глицерин (2: 1) или вода — 96 %-ный спирт—глицерин (1: 1: 1) с добавлением фенола или другого консерванта. В те-чение 1—2 суток размачивают мелкие семена, плоды, листья, травы, цветки.
Коры, корни, корневища, твердые плоды и семена с плотной кожурой, толстые стебли рекомендуется размачивать 3—5 суток. Для этих же объектов можно воспользоваться мацерацией в воде в течение 1—3 ч для набухания; затем объекты переносят в смесь глицерина со спиртом (1: 1) и выдерживают 1—3 суток. Для уплотнения тканей материал помещают на 20—30 мин в спирт или в смесь спирт—глицерин (2: 1).
Размягчение в парах воды. Главным отличием от холодного размачивания является отсутствие контакта сырья c водой. Способ более длительный, одна-ко он гарантирует сохранность структуры и содержимого клеток, предохра-няя его от вымывания, возгонки, чрезмерного набухания или ослизнения. Размягчение проводят во влажной камере, которой может служить колба или эксикатор с водой. Сырье в камере находится в чашке или стаканчике
и увлажняется водяными парами. Объекты мягкие и тонкие оставляют в атмо-сфере камеры на сутки, твердые — на 2 и более суток.
Горячий способ размягчения.
Размягчение в воде. Наиболее простой и быстрый способ заключается в кипячении сырья в воде. Тонкие листья и цветки не требуют сложной
и продолжительной подготовки. Их обычно размягчают, погружая в горячую воду. Небольшие кусочки растительного материала длиной 1—2 см обычно кипятят 3—5 мин; кору и подземные органы растений — 20—30 мин, в зави-симости от плотности и степени одревеснения тканей.
Плоды и семена не кипятят, а распаривают: помещают в марлевом ме-шочке на 15—30 мин в пары кипящей воды так, чтобы они не были погруже-ны в воду.
|
|
|
NB! Следует помнить, что путем вымачивания или кипячения сырья
в воде из клеток удаляется водорастворимое содержимое. Крахмаль-ные зерна при кипячении в воде клейстеризуются.
Размягчение в растворе щелочи. Для размягчения и одновременного про-светления кусочки листовой пластинки (с краем листа, участком главной жилки) помещают в фарфоровую чашку или химический стаканчик и кипя-тят в 3—5 %-ном растворе натрия (калия) гидроксида в течение 2—5 мин
в зависимости от толщины объекта. Жидкость сливают, а сырье промывают водой. Обработанный материал оставляют в воде и готовят из него препараты с поверхности.
3 2 Тема 1. Определение подлинности растительного сырья
Препараты кожуры плодов и семян готовят после кипячения в 5%-ном растворе калия гидроксида в течение 15—20 мин, с последующим раздавли-ванием и разделением тканей.
Размягчение в растворе хлоралгидрата. Для быстрого приготовления сре-зов коры и подземных органов их размягчают и просветляют кипячением в растворе хлоралгидрата в течение 10—20 мин.
Разрушение тканей. В некоторых случаях требуется разрушение тканей (дез-интеграция). Для изучения отдельных элементов проводящих пучков и меха-нических тканей кусочки сырья длиной 1—2 см или грубый соскоб нагрева-ют (осторожно, под тягой! ) в пробирке в смеси 2 мл кислоты азотной кон-центрированной и 0, 3 г калия хлората (бертолетовой соли) до образования пены и оставляют на несколько минут до побеления кусочков. Сырье промы-вают несколько раз водой, помещают на предметное стекло, разделяют пре-паровальной иглой на отдельные элементы и просматривают в глицерине.
При исследовании сырья, содержащего секреторные ходы, млечники, вместилища со смолой или эфирным маслом, для разделения тканей без разрушения тонких оболочек клеток применяют следующие способы: а) ки-пячение в 3—5 %-ном растворе щелочи в течение 30 мин; б) нагревание сырья в колбе со шлифом в 25 %-ном растворе аммиака в течение 40 мин. После кипячения частицы сырья промывают водой, помещают на предмет-ное стекло и разделяют ткани препаровальными иглами.
|
|
|
Приготовление временных микропрепаратов. После соответствующейподготовки сырья из него готовят микропрепараты. Техника их приготовле-ния разнообразна и зависит от состояния сырья и его принадлежности к определенной морфологической группе (лист, кора, подземные органы).
Приготовление препаратов с поверхности. Для приготовления микропре-парата листа с поверхности мелкие листья используют целиком, от крупных берут отдельные участки с учетом распределения важнейших диагностиче-ских элементов: край листа, зубчик по краю листа, участок главной жилки, верхушку листа и основание. Лист или его часть вынимают лопаточкой или препаровальной иглой и помещают на предметное стекло в раствор хлорал-гидрата или глицерина. Если объект собирается в складочки, предметное стекло
в воде подводят под кусочек сырья и вынимают его иглой на стекло. Если лист надо рассматривать с двух сторон, кусочек листовой пластинки режут на две части скальпелем на предметном стекле; одну часть осторожно пере-ворачивают и помещают обе части рядом.
Из толстых и кожистых листьев при необходимости готовят давленые препараты или поперечные срезы. При анализе резаных листьев выбирают несколько кусочков с крупной жилкой и краем листа.
Препараты цветков для микроскопического анализа готовят из отдель-ных частей соцветия (цветки, листочки обвертки) и частей цветка (лепест-ки, чашелистики), рассматривая их с поверхности. Для идентификации пло-дов и семян готовят поперечные срезы. Для микродиагностики коры и подзем-ных органов из предварительно размягченного сырья готовят поперечные, реже продольные срезы.
Приготовление срезов. Для изучения тканей и органов, обладающих твер-дой структурой, готовят срезы. Срезы, предназначенные для микроскопиче-ского исследования с учебными целями, делают преимущественно вручную, при помощи бритвы.
Для приготовления среза крупные объекты (корни, корневища, кору, плоды, семена, толстые кожистые листья) можно просто держать в руке. Мелкие объекты, которые неудобно держать пальцами, или тонкие, кото-
| Микроскопический анализ ЛРС | 3 3 | |
рые гнутся при нажиме бритвы, зажимают в сердцевину бузины, корковую пробку или заливают в парафин.
Сердцевина бузины используется для нежных объектов (листья, цветки, чашелистики и др. ), пробка — для более твердых объектов (тонкие корни, кора, плоды, плотные листья и др. ). Пробки выбирают мягкие, их предвари-тельно вываривают в воде примерно 15 мин до размягчения. Перед изго-товлением срезов кусочки сердцевины бузины 1—1, 5 см длины или размяг-ченную пробку разрезают вдоль на две части. Объект зажимают между двумя половинками и делают срезы, направляя лезвие бритвы вдоль щели. Объект срезают вместе с бузиной или пробкой, кусочки которых потом отделяют иглой от срезов и выбрасывают. Обычно готовят серию срезов от нескольких разных кусочков сырья, чтобы обеспечить наличие в препарате всех диагнос-тических признаков.
|
|
|
Очень мелкие плоды, семена или другие объекты при необходимости за-плавляют в парафин. Из парафина готовят кубик, удобный для удерживания пальцами, затем в одну из поверхностей кубика вкладывают кончик нагре-той препаровальной иглы, в расплавленное углубление быстро погружают объект и ожидают, когда парафин застынет. Срезают верхнюю часть объекта
и отбрасывают, делая затем поперечные или продольные срезы из средней части семени или плода. Их освобождают от парафина и заключают в соот-ветствующую жидкость.
Приготовление фиксированных микропрепаратов. Для хранения и длитель-ного использования готовят фиксированные микропрепараты. На нагретое предметное стекло с помощью стеклянной палочки наносят каплю расплав-ленного глицерин-желатинового реактива. В каплю сразу же помещают раз-мягченный объект или срез, который быстро накрывают покровным стек-лом, избегая образования пузырьков воздуха. К препарату приклеивают эти-кетку с наименованием.
Приготовление глицерин-желатинового реактива. К 1, 0 г чистого желатина приливают 50 мл воды для набухания. Излишек воды отцеживают, прибавля-ют 6 мл очищенной воды, нагревают до растворения желатина, к раствору прибавляют 7 г чистого глицерина и перемешивают. На 100 мл реактива в качестве консерванта прибавляют 1—2 кристаллика фенола. Смесь нагревают на водяной бане в течение 10—15 мин, пока раствор не станет прозрачным. Фильтруют на горячей стеклянной воронке через фильтровальную бумагу. Реактив хранят в конической колбе, закрытой корковой пробкой, в центр которой вставлена стеклянная палочка, доходящая почти до дна колбы.
Приготовление микропрепаратов растительных порошков. Микропрепараты растительного порошка всех морфологических групп сырья готовят одинако-во. На предметное стекло вначале помещают 2—3 капли раствора хлоралгид-рата, а затем на кончике скальпеля или увлажненной препаровальной иглы вносят частицы порошка, перемешивают препаровальной иглой до равно-мерного смачивания всех частиц жидкостью, накрывают покровным стеклом
и слегка придавливают ручкой иглы. Избыток жидкости удаляют полоской фильт-ровальной бумаги. Если жидкости под стеклом оказалось мало, ее добавляют пипеткой рядом с покровным стеклом (она быстро затягивается под стекло).
Микропрепараты прогревают над небольшим пламенем горелки или на электроплитке до просветления тканей, не допуская высыхания. Держать препарат при прогревании следует наклонно, под углом 10—15°, — так из объекта лучше удаляются пузырьки воздуха. Нельзя допустить резкого заки-
пания жидкости, так как при этом частицы порошка не просветляются, а препарат заполняется пузырьками воздуха.
3 4 Тема 1. Определение подлинности растительного сырья
При исследовании порошка коры, подземных органов, плодов или семян основной микропрепарат готовят в растворе хлоралгидрата для изучения глав-ных диагностических признаков, выявления слизи, алейроновых зерен, кристаллов и др. Для обнаружения крахмала микропрепарат приготовляют в воде или глицерине без нагревания.
Химические реакции. Составной частью микроскопического анализа яв-ляется проведение гистохимических реакций. С одной стороны, они позволя-ют установить наличие в ЛРС действующих веществ (жирное и эфирное мас-ло, смолы, содержимое млечников, слизь, инулин, алкалоиды, дубильные вещества и др. ) и нередко их локализацию в тканях растения. С другой сторо-ны, при помощи гистохимических реакций определяют различные части клетки, характер оболочки, ее одревеснение, содержимое клеточного сока, включения. Необходимые гистохимические реакции проводят на поперечном срезе размягченного сырья или с порошком (соскобом) сухих органов рас-тения.
Микросублимация. Для порошков некоторых видов ЛРС (коры, подземных органов) диагностическое значение имеет микросублимация действующих веществ. Для проведения возгонки на дно сухой пробирки на высоту около 3 мм помещают порошок исследуемого сырья. Пробирку держат горизонталь-но и нагревают в месте нахождения порошка в пламени горелки. Наблюдают возгонку веществ в виде налета на холодных стенках пробирки. С сублиматом проводят химическую реакцию, как указано в частных статьях.
|
|
|
