 |
Основные методы исследования системы гемостаза
|
|
|
|
Основные методы исследования системы гемостаза
Определение времени свёртывания крови по способу Мак-Магро:
Последовательность определения: На парафинированное часовое стекло предварительно помещают большую каплю вазелинового масла. В капилляр гемометра Сали набирают свежую кровь до метки 20 мкл, предварительно смочив его изнутри вазелиновым маслом. Быстро выдувают кровь в толщу капли вазелинового масла на часовом стекле. Через каждые 2 минуты, погружая конец микропипетки в эту каплю крови, вновь набирают её в капилляр при помощи резиновой груши и быстро выдувают на часовое стекло. С момента наступления свёртывания крови набрать в капилляр ее становится невозможно. Отмечают время от начала взятия крови до момента свертывания. Время свертывания крови, определенное по этой методике, колеблется от 8 до 12 минут при температуре воздуха 15 — 25°С (при гемофилии А оно увеличивается до нескольких часов; при наклонности к тромбообразованию уменьшается).
Капельный способ (Моравитца, Альтгаузена).
Последовательность определения: Стеклянной палочкой переносят свежую каплю крови на парафинированное сухое часовое стекло. Через каждые 30 с проводят по капле крови стеклянной палочкой с шариком на конце или острием скарификатора. Отмечают время, когда за палочкой потянутся первые нити фибрина. Этот момент считают началом свёртывания крови. Время свёртывания крови определяют по интервалу между появлением капли крови на пальце и образованием нитей фибрина. В норме он составляет 3—5 минут при комнатной температуре. Метод широко применяют в клинической практике; позволяет выявить лишь грубый дефицит факторов свертывания. У детей грудного возраста и более старших свертывание крови происходит в течение 4–5, 5 минут.
|
|
|
Унифицированный двупробирочный метод Ли-Уайта.
Определение времени спонтанного свертывания нестабилизированной крови при 37° C в несиликонированной и силиконированной пробирках. Норма составляет 5—7 мин в несиликонированной пробирке, 15—25 мин в силиконированной пробирке.
Определение протромбинового времени(Метод Квика) – время свёртывания цитратной плазмы в присутствии тканевого тромбопластина и хлорида кальция. Норма 12 – 20 с. Определяет образование протромбиназы по внешнему пути. Увеличение времени свидетельствует о снижении в крови факторов II, V, VII, Х более чем на 60 % от нормы или фибриногена менее 1 г/л (тенденция к гипокоагуляции). Уменьшение времени указывает на увеличение этих факторов или фибриногена в крови (тенденция к гиперкоагуляции).
Определение продолжительности кровотечения (уколочная проба по Дюке). Последовательность определения: Стерильным скарификатором делают глубокий укол в мякоть пальца обследуемого и сразу же начинают отсчёт времени.
|
|
При этом пациент каждые 15 секунд должен прикасаться очередным сектором фильтровальной бумаги (по часовой стрелке) к выступающей капле крови так, чтобы на бумаге каждый раз оставался только один отпечаток. Момент, когда на фильтровальной бумаге появляется последний отпечаток, отмечается как окончание кровотечения. Оно обусловлено образованием белого тромба, состоящего в основном из тромбоцитов, лейкоцитов и фибрина. В нормевремя кровотечения, определяемое таким способом, составляет 2 - 3 минуты. Время кровотечения у детей колеблется в пределах 2 - 4 минут во все возрастные периоды.
Спонтанная остановка кровотечения после повреждения мелких сосудов происходит главным образом благодаря способности тромбоцитов к адгезии и агрегации в месте повреждения, а также высвобождению из активированных тромбоцитов высокоактивных сосудосуживающих веществ — серотонина, адреналина, тромбоксана. Секреция серотонина (часто вместе с гистамином) из тромбоцитов в процессе реакции высвобождения или агрегации происходит под влиянием различных активаторов: коллагена, тромбина, АДФ, комплексов антиген—антитело, ФТА.
|
|
|
Организация самостоятельной работы на занятии.
РАБОТА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ
Оснащение: Для определения групповой принадлежности крови по системе АВО необходимо иметь стандартные сыворотки 4-х групп крови 2-х серий или цоликлоны анти-А, анти-В, анти-АВ маркированные тарелки, предметные стекла, спирт, ватные тампоны, 0, 9 % раствор хлорида натрия, донорская кровь.
Методика. Группы крови определяют по антигенным свойствам эри-троцитов, которые устанавливаются с помощью стандартных сывороток, содержащих известные агглютинины. Работу рекомендуется проводить в хорошо освещенном помещении при температуре от +15°до +25°. На маркированную тарелку наносят в соответствующий сектор по 1-2 капли стандартной гемагглютинирующей сыворотки 1, 2, 3, 4 групп. Углом предметного стекла взять немного крови, внести в каплю сыворотки 1 группы и хорошо перемешать. Количество исследуемой крови (эритроцитов) должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества сыворотки, с которой ее смешивают. Другим углом стекла внести кровь в каплю сыворотки 2 группы и т. д. Слегка покачивая тарелку, следить за агглютинацией эритроцитов. Через 3 мин после наступления агглютинации следует добавить по 1 капле 0, 9 % раствора хлорида натрия для исключения неспецифической агглютинации. Окончательный результат читают через 5 минут. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным взглядом в виде мелких красных агрегатов, быстро сливающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.
Определение группы крови с помощью моноклональных цоликлонов:
Для этого используются растворы с аналогами агглютининов α и β (эритротест цоликлон анти – А розового цвета и анти – В синего цвета), При смешивании на сухом стекле капли цоликлонов и капли крови (в десятикратно уменьшенном размере) в течение 2, 5-5 минут происходит непосредственное взаимодействие агглютиногенов исследуемых эритроцитов с одноимёнными синтетическими агглютининами (антителами) в виде реакции агглютинации. Она позволяет определить наличие или отсутствие агглютиногенов в соответствии с принадлежностью к группам крови: 0, А, В, АВ. Интерпретация результатов реакции агглютинации исследуемой крови с цоликлонами представлена в таблице:
|
|
|
| Результат реакции с цоликлоном | Группа исследуемой крови | ||
| анти-А | анти-В | анти-АВ | |
| - | - | - | 0(I) |
| + | - | + | А (П) |
| - | + | + | В (Ш) |
| + | + | + | AB(IV) |
Примечание: знаком + обозначено наличие агглютинации, знаком –отсутствие агглютинации. В составе цоликлонов нет высокомолекуляр-ных добавок, способных вызвать неспецифическую полиагглютинацию эритроцитов, поэтому не требуется проведения контроля с растворителем. При положительном результате реакции агглютинации со всеми тремя цоликлонами необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого смешайте на плоскости одну каплю исследуемой крови (эритроцитов) с каплей изотонического раствора хлорида натрия. Кровь можно отнести к группе АВ (IV) только при отсутствии агглютинации эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида.
Рекомендации к оформлению протокола. Определите, к какой группе крови принадлежит исследуемая кровь. Укажите состав её агглютиногенов и агглютининов. Зарисуйте все виды реакций взаимодействия сыворотки и крови для каждой группы. Объясните причину появления или отсутствия агглютинации. В выводах укажите правила переливания крови.
РАБОТА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ФАКТОРА ЭКСПРЕСС-МЕТОДОМ В ПРОБИРКАХ БЕЗ ПОДОГРЕВА
Оснащение: Для работы необходимо иметь специальную сыворотку универсальный реагент–антирезус анти-Д или цоликлон анти–Д, пробирки объемом не менее 10 мл. 0, 9% раствор хлорида натрия, микропипетки, ватные тампоны, спирт, донорскую кровь.
|
|
|
Методика. На дно пробирки внесите 1 каплю антирезусной сыворотки (или цоликлона анти-Д) и 1 каплю исследуемой крови. После этого содержимое перемешивают, наклоняя пробирку и вращая её вокруг оси, распределяя содержимое по стенкам ровным слоем. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает ее крупно-лепестковой. Агглютинация на стенках пробирки появляется, как правило, в течение первой минуты. Для образования устойчивого комплекса «антиген – антитело» и четко выраженной агглютинации, а также в случае замедленной реакции при слабо выраженном резус-антигене наблюдение следует проводить не менее 3–5 мин. Пробирку вращают в течение 5 мин, после чего добавляют в пробирку 2–3 мл физиологического раствора для исключения неспецифической агглютинации эритроцитов и аккуратно перемешивают, 2–3 раза наклоняя пробирку до горизонтальной плоскости (не взбалтывая! ). Оценку результатов проводить визуально по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. При положительном результате агглютинаты различимы в виде красных зерен или хлопьев на прозрачном, почти бесцветном фоне жидкости. При отрицательном результате в пробирке видна равномерно окрашенная в розовый цвет слегка опалесцирующая жидкость.
Рекомендации к оформлению протокола: По полученным результатам определите резус–принадлежность исследованной крови, опишите причину появления или отсутствия агглютинации. Нарисуйте пробирки с реакцией резус–отрицательной и резус–положительной крови. В выводах укажите отличие резус–фактора от групп крови и правила переливания крови с учётом резус–принадлежности.
РАБОТА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВРЕМЕНИ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
Методика. На предметное стекло нанести каплю свежей крови. Определить, за сколько минут кровь свернется с образованием сгустка. Свертывание крови считается законченным, если капля не растекается по стеклу при покачивании. Аналогично наблюдают за каплей, нанесенной на предметное стекло, предварительно согретое и охлажденное. Пронаблюдать за состоянием крови, смешанной с раствором цитрата натрия в течение 10 минут. Сравнить полученные результаты с нормальным временем свёртывания. Дать оценку времени свертывания крови во всех наблюдаемых состояниях. В случае использования донорской крови длительного хранения объяснить причины невозможного выполнения работы. В выводах дать общую характеристику механизмам процесса свёртывания крови и указать факторы, влияющие на скорость развития гемокоагуляции.
|
|
|
