 |
33. Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном. Расчет констант комплексообразования реакции антиген-антитело в прямых координатах.
|
|
|
|
33. Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном. Расчет констант комплексообразования реакции антиген-антитело в прямых координатах.
Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном это наиболее простой случай, пример: связывание гаптена с Fab-фрагментами моноклональных антител. Описывается схемой (над стрелкой вправо k1, под стрелкой влево k-1): 
(Аг-совбодный антиген, Ат – свободн. антитело, Аг× Ат – комплекс антиген-антитело, k1 и k-1 – константы скоростей ассоциации и диссоциации комплекса соответственно.
[Ат]0=[Ат]+[Аг× Ат]
[Аг]0=[Аг]+[Аг× Ат] отсюда с учетом конст. диссоциации Ка 1)
Ка= 
, Ка –конст. диссоциации 2)
Получим выражение равновесной концентрации образовавшегося комплекса
[Аг× Ат]= 
3)
В прямых координатах рассматривается зависимость образующегося комплекса от общей концентрации антигена [Аг]0, если при достаточно больших концентрациях антигена в сиситеме выполняется условие [Аг]0> > [Ат]0, то уравн. равновесной концентрации принимает вид:
[Аг× Ат]= 
4) это аналог уравнения Михаэлиса-Ментена в ферментативной кинетике, или изотермы адсорбции Лэнгмюра в теории адсорбции.
Из этого уравнения следует: при предельных значениях концентрации [Аг]0 концентраця комплекса [Аг× Ат] стремится к общей концентрации центров связывания [Ат]0. Для вычисления К определяют концентрацию антигена [Аг]’0, при которой половина антител находится в виде комплекса с антигеном ([Аг× Ат]=[Ат]0/2). Из 1) и 3) можно получить [Аг]’0=1/К + [Ат]0/2, откуда [Аг]’0=1/K при условии 1/К> > [Ат]0 (т. е. либо антитела являются низкоаффинными; либо их концентрация мала) При обратном соотношении (1/К < < [Ат]0 ) данный метод определения К неприемлем.
|
|
|
Рис. Зависимость концентрации образующегося комплекса от общей концентрации антигена в растворе.
34. Получение конъюгатов белок-фермент. “Нековалентные” методы (метод гибридных антител).
Основное требование при получении коньюгатов белок-фермент: белок сохраняет иммунохимические свойства, фермент сохраняет ферментативную активность.
Считается оптимальным соотношение фермент-белок 1: 1.
Увеличение числа мол-л фермента приводит к сниж. иммунологических св-в белка, т. к.: 1) увелич-ся вероятность стерических затруднений при протекании иммунохим. р-ций; 2) увелич-ся вероятность связывания фермента с акт. центром антитела или антигенной детерминантой антигена.
Методы получения есть химические(образуется ковалентная связь): при помощи гомобифункциональных (напр. глутаровый альдегид) и гетеробифункциональных(напр. N-оксисукцинимидный эфир м-малеимидобензойной кислоты(MBS)) реагентов;
и нековалентные: используются высокоспецифические иммунологические связи антиген-антитело или межмолекулярные связи белок-белок.
К нековалентным методам относится метод гибридных антител:
Смесь F(ab’)2 – фрагментов мол-л Ат против определяемого Аг и фермента обрабатывают меркаптоэтанолом. При этом F(ab’)2 – фрагменты обратимо диссоциируют на Fab-фрагменты. После удаления восстанавливающего агента мол-лы снова ассоциируют, в рез-те образуются гибридные моллекулы антител, специфичные к антигену и ферменту. При добавлении к гибридным молекулам фермента образуется коньюгат антитело-фермент(точками тоже связь нарисована):
[F(ab’)2]Аг под дей-м HSCH2CH2OH [Fab]Аг à фермент(Е)
|
|
|
[F(ab’)’2]E --------------------------------à [Fab]E à [F(ab')2]Аг, Е -----------à
à F(ab’)2…(Е)
Белок А стафилококка способен образовывать прочный комплекс с Fc-фргаментом антител à получают конъюгаты, в к-х фермент, предварительно сшитый каким-либо хим. способом с белком А, соед-ся с Fc-фрагментом антител через белковую “ножку”: (E) + (A)à (E)—(A), доб-ть (Ат) à (E)—(A)…(Aт)
Перспективный способ – метод с использ-м комплекса авидин-биотин, к-рый образ-ся с Ка~1015M-1 по схеме: (Ат)+(Б)à (Ат)—(Б)
(Е)+(А)à (Е)—(А) (Ат)—(Б)…(А)—(Е)
(синт-ся хим. методом конъюгаты Ат с биотином и фермента с авидином, а затем простым смешиванием реагентов – конъюгат)
Все неков. м-ды: 1)просты в проведении 2) в конъюгате сохр-ся ферментативная и иммунологическая активности 3)можно получить универсальный реагент для ИФА различных антител(Ат).
|
|
|
