 |
48. Физико-химические свойства ферментов, используемых в ИФА. b-D-галактозидаза.
|
|
|
|
48. Физико-химические свойства ферментов, используемых в ИФА. b-D-галактозидаза.
Иногда в состав активных центров входят кофакторы – низкомолекулярные органические вещества довольно сложного строения или неорганические ионы. Кофактор, прочно связанный с белковой глобулой (апоферментом) и остающийся в неизменном состоянии после каталитического акта называют простетической группой(это например молекула гема, принимающая участие в катализе пероксидазой).
Иногда кофактор менее прочно удерживается в активном центре и химически изменяется в результате протекания каталитической реакции. Они называются коферменты (например АТФ).
В ИФА введение ферментной метки осуществляется путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена и антитела. При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации.
b-D-галактозидаза.
b-D-галактозидаза Из E. coli имеет молекулярную массу около 540. 000, молекула содержит значительное число SH – групп. Фермент катализирует гидролиз в-d- галактозидов, обладает достаточной стабильностью. Ионы Na+ являются ингибиторами фермента. Метод регистрации активности фермента – фотометрический(В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. Окрашенные соединения поглощают видимый свет, т. е. электромагнитное излучение с длинами волн 400–700 нм. ). b-D-галактозидаза Является широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА.
49. Физико-химические свойства ферментов, используемых в ИФА. Пероксидаза хрена.
|
|
|
Иногда в состав активных центров входят кофакторы – низкомолекулярные органические вещества довольно сложного строения или неорганические ионы. Кофактор, прочно связанный с белковой глобулой (апоферментом) и остающийся в неизменном состоянии после каталитического акта называют простетической группой(это например молекула гема, принимающая участие в катализе пероксидазой).
Иногда кофактор менее прочно удерживается в активном центре и химически изменяется в результате протекания каталитической реакции. Они называются коферменты (например АТФ).
В ИФА введение ферментной метки осуществляется путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена и антитела. При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации.
Пероксидаза хрена (ПХ) – глобулярный белок, Mr – 40000. Молекула состоит из апофермента и простетической группы – гемина. Ионообменной хроматографией разделяется на 7 изоферментов: A-1, A-2, A-3, B, C, D, E (они отличаются по аминокислотному и углеводному составу). В коммерческих препаратах ПХ в основном содержится изофермент C. В его состав входит 308 АК остатков и 8 нейтральных углеводных остатков, стабилизирующих фермент относительно воздействия протеолитических ферментов. Углеводные остатки также имеют значение при синтезе конъюгатов методом перйодатного окисления. Молекула изофермента C имеет 6 остатков лизина, содержащих свободные аминогруппы, 4 и из которых находятся вблизи поверхности белковой глобулы и легко доступны для модификации.
Степень чистоты препарата характеризуется величиной RZ, равной A403/A275 нм. RZ хорошо очищенных препаратов больше либо равно 3. 0
Для приближенной оценки концентрации ПХ ( в мг/ мл) в водном растворе pH 6-7 используют соотношение: С=A403*0, 44.
|
|
|
Фермент катализирует двухсубстратные реакции с участием перекиси водорода (реже органических гидроперекисей). На первой стадии взаимодействие фермента с перекисью приводит к образованию промежуточной окисленной формы. На второй стадии происходит одноэлектронное восстановление вторым субстратом, являющимся донором водорода, с образованием второй промежуточной формы фермента, которая после взаимодействия со второй молекулой донора переходит в нативный фермент. ПХ обладает высокой специфичностью по второму субстрату и способен окислять о-фенилендиамины, о-дианизидин, анилины и др. органические и неорганические соединения.
Для измерения каталитической активности ПХ используют методы: фотометрический, флуориметрический, хемилюминесцентный, электрохимический. Хромогенные субстраты: о-фенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота. Субстраты для флуориметрического метода: гомованилиновая кислота или n-оксифенилпропионовая кислота.
50. Получение конъюгатов гаптен-фермент. Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими карбоксильную группу.
Есть ряд особенностей, по сравнению с синтезом конъюгатов белок-фермент: 1) многие гаптены плохо растворимы в водных р-рах и поэтому получение конъгатов приходится проводить в водно-органической среде, что влияет на ферментатив. актив.; 2) сложно очистить конъгат от чистого фермента, поэтому надо проводить синтез с высоким выходом; 3) для сохранение иммуногенных свойств гаптен фермент должен быть пришит к ферменту через «углеводородную ножку», содерж. 5-6 элементов цепи.
Надо тщательно выбирать место пришивки гаптена к ферменту, т. к. это влияет на специфичность анализа. Гаптен: фермент должен отвечать составу 1: 1, поэтому для синтеза в основном используются гетеробифункциональные реагенты.
|
|
|
