 |
42. Получение коньюгатов для ИФА. Общие принципы и требования к методам синтеза коньюгатов.
|
|
|
|
42. Получение коньюгатов для ИФА. Общие принципы и требования к методам синтеза коньюгатов.
В ИФА используются конъюгаты антигенов (гаптенов) и антител с различными белками, синтетическими полимерами, ферментами и их субстратами и кофакторами.
Основные задачи ИФА, связанные с необходимостью синтеза конъюгатов:
1. Получение специфических антисывороток к низкомолекулярным соединениям – гаптенам;
2. Получение меченных ферментом или субстратом антигенов (гаптенов) и антител;
3. Получение иммобилизованных на твердой фазе гаптенов через конъюгат гаптен-носитель (белок, полимер).
Требования, которым должны удовлетворять методы синтеза различного рода конъюгатов:
1. Должны сохраняться ферментативные, иммунологические или антигенные свойства конъюгата;
2. Конъюгат должен легко выделяться из реакционной смеси при использовании соответствующих методов очистки;
3. Выход конъюгата должен быть достаточно высоким;
4. Конъюгат должен быть определенного состава;
5. Полученный конъюгат должен быть стабилен при хранении.
43. Расчет констант комплексообразования при взаимодействии одной субпопуляции антител с поливалентным антигеном.
Данный случай реализуется, если Fab-фрагменты моноклональных антител взаимодействуют с вирусными частицами, клетками, т. е. имеющими на своей поверхности большое число одинаковых центров связывания. Выражение для константы равновесия взаимодействия антитела имеющего по n эпитопов, записывается следующим образом.
Уравнение Стэтчарда в этом случае примет вид
Варьируя концентрацию антител при постоянной концентрации антигена, можно определить константу комплексообразования К и число мест связывания в антигене 
.
|
|
|
Так как молекулы антител обладают минимум двумя центрами связывания, то при взаимодействии с поливалентным антигеном возможно образование так называемых комплексных связей, когда после взаимодействия одного активного центра молекулы антитела с одним из эпитопов второй активный центр взаимодействует с расположенным по близости вторым эпитопом той же молекулы антигена. Общая эффективность взаимодействия в этом случае существенно возрастает.
44. Фотометрические, флуоресцентные, хемилюминесцентные субстраты; преимущества и недостатки.
Фотометрический метод.
Наиб. распространение получили ортофенилендиамин, тетраметилбензидин.
В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. Окрашенные соединения поглощают видимый свет, т. е. электромагнитное излучение с длинами волн 400–700нм. Поглощение света подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера, в соответствии с которым оптическая плотность раствора в определённом диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества. Для измерения оптической плотности используется спектрофотометр.
Флуориметрический метод.
Плюсы: Более чувствительны;
для них характерна более низкая фоновая реакция;
Интенсивность флуоресценции обр-ся продукта стабильна по крайней мере в теч. 4 часов;
Раствор субстр. м. б. приготовлен заранее и м. храниться длит. время (при -20 вроде)
Исп-ся субстраты, которые образуют продукты, регистрируемые флуориметрическим методом. Молекула при поглощении фотона переходит из основного электронного состояния в возбуждённое.
Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству света, адсорбированного образцом. Таким образом, она прямо пропорциональна концентрации растворённого вещества и абсолютному значению начальной интенсивности света, в то время как в фотометрии сравниваются относительные интенсивности, адсорбированные образцом. Этот факт позволяет на 1–2 порядка повысить чувствительность определения вещества в растворе флуориметрическим методом по сравнению с фотометрическим.
|
|
|
Биолюминесценция и хемилюминесценция.
плюсы: Большая чувствительность в сравнении с субстратами для фотометрич. мет-в.; Длительный хемилюминесцентный сигнал более 7 часов,
Использование меньшего количества определяемого образца и антител
минусы: трудоемкость (так как маленькие объемы)
В качестве детектирующих систем в ИФА нашли применение ферментативные реакции, энергия которых реализуется в виде светового излучения — реакции био- и хемилюминесценции. За скоростью таких реакций следят по интенсивности свечения реакционной системы, регистрируемой с помощью люминометра. Реакции биолюминесценции катализируются люциферазами светляков и бактерий, а реакция окисления циклических гидразидов перекисью водорода (реакция хемолюминесценции) катализируется пероксидазой хрена.
|
|
|
