 |
Неконкурентные методы. 2) на твердой фазе иммобилизованы антитела; детектором является исследуемое вещество, меченое ферментативной меткой
|
|
|
|
Неконкурентные методы
На несколько видов по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген, антитело).
Прямой метод. Подразделяется на два вида анализа:
1) исследуемое вещество непосредственно иммобилизовано на твердую фазу; связавшееся с антигеном меченое антитело является детектором;
2) на твердой фазе иммобилизованы антитела; детектором является исследуемое вещество, меченое ферментативной меткой.
Косвенный (непрямой) метод. АГ иммобилизован на твердую фазу. После блокировки, к антигену добавляют раствор специфических к нему антител. После инкубации, комплекс антиген-антитело отмывают от несвязавшихся антител и добавляют меченый анти-иммуноглобулин (анти-Ig), выступающий в роли детектора. Использование меченого анти-Ig усиливает сигнал по сравнению с прямым методом иммуноферментного анализа, тем самым увеличивая чувствительность анализа.
«Сэндвич»-метод. Наиболее распространенный неконкурентный. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.
|
|
|
Конкурентные методы
На несколько видов по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген, антитело).
1) Прямой конкурентный метод ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом.
К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.
Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.
2) В непрямом конкурентном методе ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.
|
|
|
Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.
54. Получение конъюгатов белок-фермент. Гомобифункциональные сшивающие агенты.
Основное требование при получении коньюгатов белок-фермент: белок сохраняет иммунохимические свойства, фермент сохраняет ферментативную активность.
Считается оптимальным соотношение фермент-белок 1: 1.
Увеличение числа мол-л фермента приводит к сниж. иммунологических св-в белка, т. к.: 1) увелич-ся вероятность стерических затруднений при протекании иммунохим. р-ций; 2) увелич-ся вероятность связывания фермента с акт. центром антитела или антигенной детерминантой антигена.
Из реакционной смеси конъюгаты выделяют, диализом или путем гельфильтрации, а для очистки иногда применяют аффинную хроматографию.
Методы получения есть химические(образуется ковалентная связь): при помощи гомобифункциональных (напр. глутаровый альдегид) и гетеробифункциональных(напр. N-оксисукцинимидный эфир м-малеимидобензойной кислоты(MBS)) реагентов;
и нековалентные: используются высокоспецифические иммунологические связи антиген-антитело или межмолекулярные связи белок-белок.
Кроме того, для получения конъюгатов белков с пероксидазой хрена широко используется перйодатный метод.
|
|
|
Получение конъюгатов с помощью гомобифункциональных сшивающих реагентов.
1) с глутаровым альдегидом (в основном для пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и глюкоамилазы): взаимодействует с ε -аминогруппами лизиновых остатков антител и фермента. Механизм реакции глутарового альдегида с белками до конца не изучен. Одновременно протекает несколько реакций, приводящих к появлению смеси продукта, содержащих более прочные химические связи, чем в простых основаниях Шиффа. Однако в общем виде схему реакций можно записать в следующем виде:
1. (Е)—NH2 + O=CH(CH2)3CH=O à (Е) —N= CH(CH2)3CH=O
в одностадийной схеме глутаровый альдегид добавляют к смеси фермента и белка
в двухстадийном на первой стадии только фермент обр-ся глутаровым альдегидом, избыток глут. альдегида удаляется, а затем уже к модифицированному ферменту добавляют белок.
2. (Е)—N=CH(CH2)3CH=0 + NH2—(Ат) à (Е) —N=CH(CH2)3CH=N—(Aт)
Недостаток метода: невысокий выход конъюгата (1—10%) и поляризация белков, в результате чего теряется иммунологическая активность.
Достоинства м-да: простота и то, что качество получаемого конъюгата удовлетворяет необходимым требованиям.
Есть м-ды синтеза конъюгата тиротропина с щелочной фосфатазой и синтеза конъюгата IgG с щелочной фосфатазой с помощью глутарового альдегида (последний одностадийный метод), и синтез конъюгата IgG с пероксидазой хрена (двухстадийный метод).
2) n-бензохинон: для получения конъюгатов IgG с пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой и бетта-D-галактозидазой. Метод основан на реакции n-бензохинона с амино- и тиогруппами белка, скорость которой зависит от pH. Благодаря этому был разработан двухстадийный способ получения конъюгатов, когда n-бензохиноновое производное белка получают при pH 6, выделяют, а затем смешивают с другим белком при pH 8. Недостатки: невысокий выход конъюгатов, они гетерогенны и имеют невысокую активность. Метод в настоящее время применяется все реже.
3) N, N'-о-фенилендималеимид: для белков и ферментов, содержащих SH-группы, в частности для получения конъюгатов антител или их фрагментов с бетта-D-галактозидазой (для синтеза конъюгата Fab-фрагмента с бетта-D-галактозидазой). Этот реагент содержащий две малеимидные группы, которые быстро реагируют с тиогруппой и медленно с другими функциональными группами белка. Однако дималеимидный метод может быть применен для получения конъюгатов и с другими белками: SH-группы могут быть введены в молекулы белков несколькими методами, в том числе путем частичного восстановления дисульфидных связей 2-меркаптоэтила-мином.
|
|
|
Дималеимидный метод может проводиться при pH не выше 6, 0—6, 5, так как малеимидные группы нестабильны при высоких pH.
Конъюгаты, полученные этим методом, практически не теряют ферментативную активность, дают низкое неспецифическое связывание и не образуют полимерных частиц.
|
|
|
