45. Термодинамические закономерности реакции взаимодействия антиген-антитело.

45. Термодинамические закономерности реакции взаимодействия антиген-антитело.

 

Константа образования комплекса – термодинам. параметр, характеризующий изменение свободной Е при взаимодействии Ат с Аг.

Δ F⁰=-RTlnK_a или K_a=e^{-Δ F/RT}

Стандартное условие: изменение 1 моль Аг и 1 моль Аг-связывающих участков Ат.

Подставив конкретные величины в ур-ние изменения свободной Е, можно показать, что 10-кратное увеличение при 37⁰С соответствует изменению свободной Е, равной 1, 42 ккал/моль (меньше Е Н-Н связей=4, 5).

Низкоаффинное взаимодействие:

↑ аффинность (10¹⁰ М^-1), изменение свободной Е -14, 2 ккал/моль, что приблизительно эквивалентно Е 3-х Н-Н связей.

Незначительное изменение структуры Аг может существенно изменить аффинность.

К_а – величина постоянная при любом заданном состоянии. При варьировании параметров=> изменения образования комплекса.

Общее изменение свободной Е при образовании комплекса:

Δ F⁰=Δ μ ⁰-Δ S⁰T – ур-ние Вантгоффа

Можно показать, что изменени аффинности от Т ⁰С описывается след. выражением:

ln от обратной Т (1/Т) – изменение Н

tgα =*, т. е. используя данный подход можно найти термодинам. параметр.

Энтальпию можно найти (изменение) с помощью прямой колориметрии.

Сильное экзотерм. Взаимодействие: ↑ аффинности, при изменении Т, Δ Н – отрицательное большое значение.

Ат+Аг при 4⁰С сильнее.

Неполярные взаимодействия (гидрофобные) опред. энтропийным S членом ур-ния. Изменение Н близко к 0. Аффинное мало зависит от Т.

Влияние значения рН и [солей] (ионная сила раствора) зависят от природы взаимодействующих групп.

рН=7 и при физиологических [солей] – 0, 15 моль NaCl.

↓ аффинность, если большую роль играют ионные взаимодействия.

 

46. Физико-химические свойства ферментов, используемых в ИФА. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

 

Иногда в состав активных центров входят кофакторы – низкомолекулярные органические вещества довольно сложного строения или неорганические ионы. Кофактор, прочно связанный с белковой глобулой (апоферментом) и остающийся в неизменном состоянии после каталитического акта называют простетической группой(это например молекула гема, принимающая участие в катализе пероксидазой).

Иногда кофактор менее прочно удерживается в активном центре и химически изменяется в результате протекания каталитической реакции. Они называются коферменты (например АТФ).

В ИФА введение ферментной метки осуществляется путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена и антитела. При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации.

 

  Глюкозо- 6- фосфатдегидрогеназа (КФ 1. 1. 1. 49)

Фермент выделен как из тканей млекопитающих, так и из бактерий. Молекула состоит из двух субъединиц, каждая из которых содержит вблизи активного центра реакционноспособный остаток лизина. В иммуноферментном анализе часто используют бактериальную глюкозо- 6- фосфатдегидрогеназу. Фермент не содержит SH- групп и обладает высокой стабильностью более 1 года при 4°С. Фермент катализирует реакцию окисления глюкозо- 6- фосфата с образованием 6-фосфо-D-глюконата:

 

Глюкозо- 6- фосфата+ NADP⁺  = 6-фосфо-D-глюконат+ NADP+ Н⁺

 

В отличии от фермента из млекопитающих бактериальная глюкозо- 6- фосфатдегидрогеназа эффективно используют в качестве кофермента не только NADP⁺ но и NAD⁺ . Большинство двухвалентных ионов металлов являются ингибиторами фермента. Mg²⁺ в концентрации до 10мМ активирует, но при высоких концентрациях также ингибирует его. Ингибирующий эффект оказывает фосфат-ионы.

Принцип измерения каталитической активности основан на регистрации образующейся в реакции восстановленной формы кофермента (коэффициент молярного поглощения NADPH при длине волны 340 нм равен 6, 22*10³ М^-1 см^-1).

 

47. Кинетические закономерности реакции взаимодействия антиген-антитело.

 

Образование, комплекса антиген—антитело является обратимым процессом, т. е. равновесная константа свя­зывания (аффинности) данного комплекса определяется отноше­нием константы скорости ассоциации к константе скорости диссоциации.

k_-1 (K= k_1/ k_-1)

Исследование кинетики процесса комплексообразования антигенов с центрами связывания антител в широком диапазоне концентраций, включая избыточные концент­рации каждого из реагентов, позволяет определить значения ки­нетических констант скоростей ассоциации и диссоциации, рас­считать время, необходимое для достижения системой равнове­сия. Реакция антиген—антитело в диапазоне таких концентраций реагентов (антигена и антител), которые регистрируются обычны­ми физико-химическими методами(спектрофотометрическими, иефелометрическими и др. ), протекает очень быстро» что затруд­няет ее изучение с помощью традиционных кинетических методов.

При высоких концентрациях реагентов лимитирующим фактором является время смешивания растворов, так как равновесие уста­навливается за время, которое не позволяет определять измене­ния концентраций реагентов.

Для нахождения кинетических констант реакции антиген—ан­титело могут быть применены два экспериментальных подхода. Первый из них состоит в использовании специальных приемов для изучения быстрых реакций — метода температурного скачка (является одним из релаксационных методов, основанных на принципе зависимо­сти времени достижения нового равновесного состояния системы, обусловленного быстрым внешним воздействием, от констант скоростей прямой и обратной реакций) и метода остановленной струи. Второе направление связано с применением реагентов, позволяющих следить за реакцией комплексообразования (этот метод, нашел большое применение в связи с развитием высокочувствитель­ных методов иммуноанализа, основанных на использовании меченых реагентов: радиоиммунологического, иммуноферментного и других методов) в области ультранизких концентраций реаген­тов. Переход к низким концентрациям реагентов (< 10~⁹ М) дает возможность значительно понизить скорость реакции и ис­пользовать для расчетов традиционные кинетические методы.

Основная часть кинетических экспериментов, приведенных в литературе, выполнена, для взаимодействия гаптенов, главным образом ДНФ-лигандов. Лишь очень небольшое количество ра­бот посвящено кинетическому исследованию взаимодействия антител с антигенами белковой природы. Это связано с тем, что кинетические данные, полученные в опытах со сложными антиге­нами, трудно интерпретировать.

Как для белковых антигенов, так и для гаптенов установлены достаточно высокие значения констант скоростей ассоциации, приближающиеся к диффузионно контролируемому пределу. В случае белковых антигенов их значения приблизительно на 2 порядка меньше и колеблются от 5- 10^s до 5 -10⁶ М^—1 • с '¹, что объясняется более сложной структурой анти­генной детерминанты белковых антигенов.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что наблюдаемые различия в аффинности антител обусловлены, в основном, значе­ниями константы скорости диссоциации. Это было наглядно про­демонстрировано в экспериментах с серией гомологичных гидро­фобных ДНФ-лиганидов, в которых десятикратное увеличение константы аффинности для двух перекрестно реагирующих ли­гандов обусловлено различием в константах скоростей диссоциа­ции, а не ассоциации. Эти и другие результаты показывают, что именно константа скорости диссоциации определяет сродство антитела к гаптену. Этот вывод, однако, нельзя считать оконча­тельным, поскольку количество экспериментальных данных, полу­ченных к настоящему времени, ограничено.

 

⇐ Предыдущая18192021222324252627Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: