 |
37. Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном. Расчет констант комплексообразования с помощью метода Хилла.
|
|
|
|
37. Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном. Расчет констант комплексообразования с помощью метода Хилла.
Этот случай реализуется при связывании гаптена Fab-фрагментами монокланальных антител и описывается схемой:
1. 1
с учетом для константы равновесия комплексообразования можно легко получить выражения равновесной концентрации образовавшегося комплекса
1. 2
Один из часто используемых способов расчета константы состоит в исследовании зависимости образующегося комплекса от общей концентрации Аг. Если при больших концентрация Аг в системе выполняется условие [Аг]0 »[Ат]0, то принимает вид
1. 3
Из выражения следует, что при предельных значениях концентрация [Аг]0 концентрация комплекса [Аг*Ат] стремится к общей концентрации центров связывания [Ат]0 Для вычисления К определяют концентрацию [Аг]’0 при которой половина Ат находится в виде комплекса с Аг ([Аг*Ат]= [Ат]0/ 2) с учетом выражений следует(1. 1; 1. 2) можно получить
1. 4
Из этого выражения следует, что [Аг]’0 = 1/К при условии 1/К» [Ат]0 (т. е. либо Ат являются низкоаффинными. Либо их концентрация мала). При обратном соотношении 1/К«[Ат]0 данный метод определения К неприемлем.
1. Иногда для вычисления константы связывания К используют представление экспериментальных данных зависимости 1. 4 концентрации комплекса от концентрации свободного Аг в системе двойных обратных координат
1. 5
При постоянной концентрации Ат в системе варьируют начальную концентрацию Аг и в условиях равновесия определяют концентрацию свободного и связанного в комплекс Аг. График двойных обратных координатах представляет собой прямую линию с тангенсом угла наклона 1/К [Ат]0, отсекающую на оси ординат отрезок 1/[Ат]0
|
|
|
В условиях избытка Аг используют [Аг]» [Ат], анализ проводят в координатах 1/ [Аг*Ат]: 1/[Аг].
Для анализа процессов комплексообразования используют метод Скэтчарда
В литературе заменяют [Ат*Аг]→ символом В, [Аг]→ F.
Аг является поливалентным и связываетя более чем с одним участком Ат. Вероятность связывается Аг более чем с однм участком Ат весьма мала. На практике для определения аффинности по методу Скэтчарда проводят серию опытов по определению равновесной концентрации свободного Аг при различных начальных концентрациях Аг и постоянной концентрации Ат.
Метод Хилла
Уравнение [ АтАг]= Ка [АтАг] с учетом системы уравнений материального баланса можно преобразовать в
Разделив числитель и знаменатель левой части равенства на концентрацию Ат, получаем
координаты Хилла
прямая с тангенсом угла наклона, равным единице, пересекающая ось ординат в точке lgК
38. Синтез коньюгатов гаптенов с носителями для получения антител.
Для придания иммуногенных св-в гаптенам, его связывают с носителем:
БСА (бычий сывороточный альбумин)
ЧСА (альбумин сыворотки человека)
Тироглобулин
Синтетические пептиды
Основные требования к носителю: его доступность, поэтому выбирают БСА.
Иммуногенность определяется числом молекул гаптена связанного с носителем. Установлено, что гомогенные св-ва коньюгатов уменьшается при слишком большом или маленьком количестве молекул гаптена пришитого к носителям.
В случае БСА эксперимента были получены следующие цифры для придания оптимальных св-в необходимо: на 1 молекулу БСА вводить 10-20 молекул гаптена.
Специфичность иммуногенов выше, когда функциональная группа гаптена удалены от места связывания с носителем поэтому необходимо тчательно выбирать группы, связывающую гаптен с носителем.
|
|
|
Этот факт необходимо учитывать при получении коньюгатов стероидов с носителем. Для получения коньюгированных гаптенов, чаще всего используют аминогруппу носителя или аминогруппу пептида с СООН групп носителя, в том случае если у гаптенов отсутствует функциональная группа, то ее вводят различными химическими способами. Способы для определения количества молекул гаптена пришитого к носителю:
ü Спектрофотометрический (изменение поглощения раствора коньюгата при определенной длине волны по сравнению с белком носителем)
ü Использовать SDS- электрофорез (разделение сложной белковой смеси, происходит по принципу: рассчитать соотношение коньюгата из данных по молекулярной массе, а SDS нужен для создания электроотрицательной оболочки.
ü Масс-спектрометрия
ü Косвенные подходы: если для поглощения коньюгатов использовать опреденное к-во аминогрупп, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп.
|
|
|
