 |
Основы гистологической техники.
|
|
|
|
Основы гистологической техники.
Для приготовления гистологических препаратов взятые кусочки тканей и органов должны пройти следующие этапы проводки: 1 - взятие материала, 2 - фиксация, 3 - промывание, 4 - обезвоживание материала, 5 - уплотнение, 6 - изготовление срезов, 7 - окрашивание срезов, 8 - обезвоживание, 9 - просветление, 10 - заключение.
1. Взятие материала. Для приготовления гистологических препаратов материал берут от животных, умерщвленных для этой цели, от животных и людей во время операции (биопсия) и от трупов.
2. Фиксация проводится для сохранения прижизненной структуры ткани и кусочков органов путем быстрой коагуляции ее белков. Различают простые фиксаторы (чаще всего 10% формалин) и сложные (смесь Ценкера, Буэна, Мюллера и др. ). Вырезанный кусочек или орган следует тотчас же опускать в заранее приготовленную фиксирующую жидкость. Количество фиксирующей жидкости должно в 20-30 раз превосходить объем кусочка. Срок фиксации тканей в формалине 24-48 часов. В большинстве случаев фиксация производится при комнатной температуре. Размер исследуемых кусочков должен быть не более 1× 1 см. Фиксирующие растворы следует готовить непосредственно перед их употреблением.
3. Промывание. По окончании фиксации объектыпромывают водой для удаления фиксатора и артефактов. Промывка длится до 1-2 суток.
4. Обезвоживание материала. При этом взятые кусочки тканей последовательно обрабатывают спиртом возрастающей концентрации (70 %, 80 %, 96 %, 100 %) в каждом растворе по 24 часа. Вслед за обезвоживанием в спиртах следует заливка материала в специальные плотные среды (парафин).
5. Уплотнение. Схема заливки в парафин:
1. Обезвоживание в спиртах 70 %, 80 %, 96 % и абсолютный спирт по 24 часа в каждом.
|
|
|
2. Погружение объекта в смесь равных частей абсолютного спирта и ксилола на 1-3 часа.
3. Перенос объекта в чистый ксилол на 3 часа.
4. Погружение в раствор парафина в ксилоле при температуре
37 градусов на 2 часа.
5. Перенос в 1-й чистый парафин на 2 часа при температуре термостата 56 градусов.
6. Перенос во 2-й чистый парафин на 1-2 часа при 56 градусов.
7. Заливка материала чистым парафином в бумажных формочках.
8. Наклеивание на деревянные кубики.
6. Изготовление срезов производится на санном микротоме толщиной 7-10 мкм. Предварительно предметные стекла очищают от грязи и обезжиривают их поверхность. Для того чтобы парафиновые срезы можно было подвергнуть дальнейшей обработке, их необходимо наклеить на предметное стекло в расправленном положении. Клеевой основой для предметных стекол служит белок куриного яйца с глицерином в равных количествах по объему. Предварительно срезы переносят в теплую воду для расправления, затем смазанное белком с глицерином предметное стекло подводят в наклонном положении под плавающий срез.
7. Окраска препаратов. Различная кислотность субстрата клетки обеспечивает избирательное отношение частей клетки к красителям. Структуры, имеющие кислую реакцию, обладают сродством к основным красителям, поэтому их называют базофильными (базофильны ядра клеток, цитоплазма белоксинтезирующих клеток). Свойство окрашиваться основными красителями – базофилия. Структуры, щелочной реакцией обладают сродством к кислым красителям ( оксифилия) и называются оксифильными (цитоплазма большинства клеток, волокна межклеточного вещества). Окраска гематоксилин - эозином наиболее распространенный метод окрашивания срезов. Гематоксилин окрашивает ядро в синий цвет, тогда как эозин окрашивает цитоплазму в красный цвет. Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева. Эозин – искусственная краска.
|
|
|
Схема окраски гематоксилин-эозином парафиновых срезов:
- Срезы, подлежащие окраске, нужно освободить от пропитывающего их парафина в 2-х порциях ксилола – 4-5 мин.
- Удалить из срезов ксилол в 100 градусном спирте – 2-3 мин.
- Выдержать срезы в 96 % спирте – 2-3 мин.
- Выдержать срезы в 70 % спирте – 2-3 мин.
- В воде дистиллированной – 1-2 мин.
- Окраска гематоксилином – 3-5 мин.
- Сполоснуть в водопроводной воде.
- Окрасить эозином – 1 мин.
- Промыть в воде.
8. Обезвоживание окрашенных срезов в спиртах возрастающей крепости по 1-2 мин.
9. Просветление в ксилоле 1-2 мин.
10. Заключение. Осуществляется путем нанесения бальзама на срез и осторожным покрытием препарата покровным стеклом. После высушивания гистологический препарат готов для изучения.
Количественная оценка клеточных и тканевых структур.
Морфометрические методы представляют собой совокупность приемов, позволяющих дать количественную оценку параметров клеточных и тканевых структур на гистологических и цитологических препаратах (или их фотографиях). Путем использования этих методов определяют такие параметры, как, например, диаметр, высоту, толщину, площадь сечения, количество объектов на единице площади, их форму и др. При морфометрии объектов на гистологических препаратах необходимо учитывать, что оцениваемые параметры относятся не к собственно тканевым компонентам, а к сечениям на срезах. Морфометрические методы могут использоваться при изучении объектов не только под световым микроскопом, но и на электронно-микроскопическом уровне.
Стереологические методы, в отличие от стандартных морфометрических, позволяют путем специальных приемов и расчетов определить истинные (трехмерные) параметры объектов (например, их относительный объем, содержание в единице объема и др. ), исходя из оценки на срезах их линейных и плоскостных параметров.
Ручная морфометрия основана на проведении подсчетов визуально, непосредственно под микроскопом или на микрофотографиях с использованием линеек, сеток (в том числе в виде окулярных вставок) и других приспособлений.
Методы полуавтоматического и автоматического анализа изображения с применением компъютеров получили широкое распространение благодаря своей высокой производительности. Они позволяют быстро количественно оценить большое число признаков на изучаемом препарате и по их совокупности идентифицировать различные структуры (например, типы клеток по распределению хроматина в их ядрах).
|
|
|
