Приборные микроскопические методы для количественной оценки гистохимических и иммуногистохимических реакций.

Приборные микроскопические методы для количественной оценки гистохимических и иммуногистохимических реакций.

Цитофотометрия – количественный приборный метод, дающий возможность оценить содержание исследуемого вещества в структурных элементах тканей и клеток. Измерения производятся на специальном приборе – цитофотометре – путем оценки оптической плотности окрашенного изучаемого вещества гистохимической реакцией в пределах определенной площади препарата (зонда) при длине световой волны, соответствующей максимуму поглощения использованного красителя. При измерении содержания ДНК полученные данные сопоставляют с результатами измерений в заведомо диплоидных клетках (например, в покоящихся лимфоцитах), что позволяет оценивать результаты в единицах плоидности.

Проточная цитометрия, или флоу-цитометрия (от англ. flow – поток) – высокоэффективный приборный количественный метод оценки содержания веществ в клетках, находящихся в суспензиях.

Подготовка клеток к анализу заключается в их окрашивании с использованием флюоресцирующих красителей в цитохимических или иммуноцитохимических реакциях. В последнем случае красители конъюгированы со специфическими антителами. При работе с тканями их предварительно обрабатывают ферментами для разрушения межклеточных связей и получения клеточных суспензий.

Окраска клеток флюоресцирующими красителями используется для маркировки искомого вещества. Некоторые вещества можно непосредственно выявить путем цитохимической реакции с избирательно связывающимся с ними красителем (например, ДНК с помощью бромида этидия). Для маркировки вещества клетки обрабатывают специфическими антителами, с которыми конъюгированы флюоресцирующие красители. При этом маркированные антитела связываются с соответствующими клеточными антителами (веществами) в результате иммуноцитохимической реакции.

Проточный цитометр (флоу-цитометр) с высокой скоростью пропускает суспензию окрашенных клеток через узкую капиллярную трубку, освещенную лучом лазера. Уровень флюоресценции каждой клетки или ее ядра (соответствующий содержанию исследуемого вещества) последовательно регистрируется с помощью специальных детекторов со скоростью до нескольких десятков тысяч клеток в 1 мин. С построением соответствующих гистограмм (графиков распределения) содержания веществ. В некоторых случаях через капилляр пропускают неокрашенные клетки (форменные элементы крови) и оценивают распределение их размеров и формы.

Клеточная сортировка позволяет выделить клетки с определенными маркерными признаками (или их сочетанием) из клеточной суспензии. Процедура реализуется с использованием специального прибора – сортера (клеточного анализатора), работающего по принципу проточного цитометра, но с возможностью формирования мелких капель, содержащих определенные клетки, которые, в зависимости от наличия маркировочного сигнала, сортируются и направляются в различные контейнеры.

Специальные типы микроскопии.

Темнопольная. Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на темном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзе микроскопа поступают только рассеянные лучи.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии.

Поляризационная микроскопия – формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы).

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов.

Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов.

Электронная микроскопия. С помощью электронного микроскопа можно изучить тончайшее строение ультрамикроструктур тканей и клеток. Главным отличием электронного микроскопа от светового микроскопа является то, что в нем вместо света применяется поток электронов, а обычные стеклянные линзы заменены электромагнитными полями. Для исследования в электронном микроскопе применяют ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома. Обработка кусочков органов и тканей размерами 1× 1 мм для электронной микроскопии принципиально сходна. Особенностью является то, что фиксация производится осмиевой кислотой, солями марганца при определенной Рн среды, а заливка осуществляется в органические смолы.

Гистохимический метод. В основе гистохимического метода лежит применение химических реакций для выявления распределения химического вещества в структурах клеток, тканей и органов. Современные гистохимические методы позволяют выявлять в структурах аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, активность ферментов.

Метод авторадиографии позволяет наиболее полно изучить обмен веществ в структурах клетки. В основе метода лежит использование радиоактивных элементов или меченых ими соединений. В организм животных вводят один из радиоактивных элементов и через определенные промежутки времени определяют его содержание в тканях и органах. Выявление радиоактивных элементов в гистологических срезах производят с помощью фотоэмульсии, которую прикладывают к препарату и затем проявляют. В участках препарата, где содержится радиоактивный элемент, имеет место радиоактивное излучение. Под влиянием этого излучения происходит восстановление бесцветного бромистого серебра в черное металлическое серебро. В фотоэмульсии на соответствующих участках наблюдается появление хорошо видимых черных зерен серебра. С помощью этого метода можно определить скорость включения аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, обмен йода в клетках щитовидной железы и т. д.

Культура тканей. Изучение культуры тканей может производиться как вне организма, так и в составе организма. Метод культуры тканей вне организма заключается в том, что клетки и ткани выращиваются вне организма, при этом клетки способны к движению, размножению, дифференцировке.