 |
Рэй Ф. Нахрайнер и Кент Р.Ревзал
|
|
|
|
Введение
Гормональные исследования продолжают играть важную роль в практике мелких домашних животных, и клинические исследования дают новый взгляд на интерпретацию результатов. Проводятся постоянные попытки оценить новые анализы на гормоны для диагностического применения, и лаборатории сегодня столкнулись с трудностью перехода с давно установленных методик радиоиммуноанализа (РИА) на иммуноанализы, методы, которые не зависят от радиоактивности. Важно, что по мере возникновения изменений в гормональных анализах, проводится постоянная оценка качества проб и работы с пробами, с тем, чтобы можно быть получать лучшие результаты. В этой главе отражены факторы, которые необходимо учитывать при соборе, хранении и работе с пробами для гормональных анализов.
Сыворотка или плазма
Большинство гормонов может быть точно и надежно проанализировано в сыворотке крови. Исключением является адренокортикотропный гормон (АКТГ), для которого в качестве антикоагулянта требуется ЭДТА, и антидиуретический гормон (АДГ), для которого имеются особые требования сбора пробы. Кортизол часто анализируется в плазме с ЭДТА в качестве консерванта, так как у некоторых животных он прикрепляется к эритроцитам после продолжительного контакта. Однако когда пробы центрифугируются с течение 30 минут после сбора, результаты сопоставимы как в сыворотке, так и плазме. Лаборатории, как правило, не используют гепарин в качестве антикоагулянта при исследовании кортизола и других гормонов, так как часто образуется фибрин, и осадок из гепариновой плазмы может собираться кончиком пипетки и сводить результаты на нет. Измерение прогестерона в пробах КРС представляет собой проблему, так как ферменты эритроцитов метаболизируют прогестерон, таким образом, ложно снижая результат. Однако у собак и кошек таких ферментов нет и поэтому специальной работы с пробами (охлаждение или быстрая обработка пробы) не требуется. Центрифугирование проб вскоре после того, как кровь свернулась, всегда считается лучшим подходом. Сепарирование сыворотки от сгустка будет гарантировать получение нужной пробы и поможет избежать гемолиза, если, например, пробы была по неосторожности заморожена.
|
|
|
Протеолиз
На такие гормоны как АКТГ, паратгормон, инсулин и АДГ часто влияет наличие протеолитических ферментов в сыворотке или плазме, и требуется специальная работа с пробами. В целом, охлаждение будет замедлять активность протеолитических ферментов. Другие средства могут угнетать протеолитическую активность, такие как апротинин; к сожалению, этот консервант не всегда легко доступен практикам. Если ингибиторы протеаз станут доступными в ближайшем будущем, они станут настоящим подспорьем в транспортировке белковых и пептидных гормонов. Из протеиновых гормонов тиреотропный гормон, по-видимому, является исключением, так как он достаточно стабилен как в сыворотке, так и плазме, даже при 37 0C; отсюда особых правил работы с пробами не требуется.
Гемолиз
В большинстве лабораторий для анализа гормонов используются методы РИА. Эти методы достаточно трудоемкие и не поддаются влиянию слабого гемолиза. Однако сильный гемолиз приводит к получению сомнительных результатов. Так как большинство лабораторий переходят на ферментные иммуноанализы и другие колометрические методы по “конечной точке”, гемолиз будет становиться значимым фактором.
Липемия
Избыточное количество липидов в крови, или липемия, не является проблемой при испльзовании многих методик РИА, так как, как правило, они считаются надежными в способности определять гормоны. Однако, по крайней мере, один коммерчески доступный прямой анализ на свободный трийодтиронин является исключением, так как концентрации его ложно повышаются, когда в пробе имеется липемия. Известно, что некоторые АКТГ анализы подвержены также влиянию липемии. Липемия также может быть проблемой при гормональных анализах, в которых используется колометрический индикатор.
|
|
|
Пробирки для отделения сыворотки
Пробирки для отделения сыворотки содержат химическое вещество, которое имеет плотность между таковой эритроцитов и сыворотки и формирует желатиновый барьер между ними. Это позволяет быстро сливать сыворотку из пробирки в контейнер, используемый для транспортировки пробы. Большое количество исследований проведено, чтобы оценить влияние пробирок для отделения сыворотки на результаты анализов. В нашей лаборатории мы обнаружили, что не было значительной разницы в результатах РИА, при использовании пробирок для отделения сыворотки; однако, отмечено, что на некоторые методы они оказывали влияние и это особенно важно, когда используются некоторые из новых не РИА методик. Необходимо всегда следовать инструкциям производителя и протоколам лаборатории.
Стеклянные пробирки
АКТГ относительно маленькая молекула, которая будет абсорбироваться на стекле; силиконовые добавки могут предотвращать это, хотя пластиковые пробирки решают эту проблему. Отсюда стеклянные пробирки с ЭДТА могут быть использованы для сбора крови, но которая должна быть перелита в пластиковую пробирку до центрифугирования или транспортировки.
Температура
Большое количество исследований проведено в нашей лаборатории за прошедшие 10 лет, чтобы определить влияние времени и температуры на стабильность гормонов в пробах крови собак. Исследованные время и температура представляют такие, которым пробы подвергаются во время транспортировки. Время варьировало, но обычно период инкубации составлял 4-7 дней, а температура инкубации обычно 4 0C, 20-22 0C и 37 0C. Концентрация гомонов определялась с помощью утвержденных РИА методик (таблица 33.1).
Хотя некоторые гормоны разрушаются из-за условий во время транспортировки, интересно отметить что измеренные концентрации свободного тироксина (Т4) при диализе повышены. По-видимому, связывающие глобулины либо теряют свое сродство с Т4, либо некоторые связывающие белки разрушаются и свободной фракции становится больше.
|
|
|
Таблица 33.1 Процент гормонов, оставшихся после инкубации при различной температуре и после разного количества дней.
| Гормон | Температура (0C) | Количество дней | Процент оставшихся гормонов | Температура (0C) | Количество дней | Процент оставшихся гормонов |
| Адренокортикотропин Альдостерон Антидиуретический гормон Кортизол Инсулин Инсулиноподобный фактор роста Паратгормон Паратгомон связанный белок Общий тироксин (Т4) Общий трийодтиронин (Т3) Свободный Т4 прямой Свободный Т3 Свободный Т4 при диализе Тиреотропный гормон собак Витамин D (1,25 дигидроксихолекациферол) |
Контейнеры
Мы протестировали большое количество коммерчески доступных контейнеров, используемых для транспортировки проб. Одним из подходящих контейнером является полистироловая коробка, размером 20 см х 16 см х 13 см с толщиной стенки 2,4 см. Коробка содержит два гелевых пакета весом 450 г: когда эти гелевые пакеты замораживаются при -24 0C, 2 мл пробы может сохраняться с температурой ниже 7 0C 24 часа, когда весь пакет храниться при 22 0C, и ниже 10 0C - 8 часов, когда весь пакет храниться при 37 0C. Отсюда пробы, для исследования активности ренина и АДГ в плазме необходимо будет транспортировать в ледяной бане, но пробы для анализа на многие другие гормоны будут надежными при ночной доставке. Результаты указывают, что большинство проб на гормоны могут транспортироваться в лаборатории на некоторое расстояние, при условии создания определенных условий для проб (таблица 33.2).
|
|
|
Таблица 33.2 Работа с пробами и советы по их транспортировке.
| Гормон | Проба | Требования для транспортировки |
| Адренокортикотропин Альдостерон Ионизированный кальций Кортизол Гастрин Инсулин Инсулиноподобных фактор роста Паратгормон Активность ренина в плазме Прогестерон Тестостерон Исследование функциональной активности щитовидной железы: Общий тироксин (Т4)* Общий трийодтиронин Прямой свободный Т4 Прямой свободный Т3 Обратный Т3 Тиреотропный гормон собак* Свободный Т4 при диализе Витамин D(1,25 –дигидроксихолекальциферол) Кортизол в моче | ЭДТА**, плазма ЭДТА**, плазма Сыворотка ЭДТА**, плазма Сыворотка Сыворотка Сыворотка Сыворотка ЭДТА**, плазма Сыворотка Сыворотка Сыворотка Сыворотка Сыворотка Сыворотка Сыворотка Сыворотка Сыворотка Сыворотка Моча | Пластиковые пробирки, замороженные до < 4 0C на 24 часа Транспортировка в гелиевых пакетах весом 1 кг (<72 часов) Ночная доставка в замороженных гелиевых пакетах весом 1 кг и корректировка результата под изменение pH Транспортировка в гелиевых пакетах весом 1 кг (<72 часов) Транспортировка в гелиевых пакетах весом 1 кг (<72 часов) Транспортировка в гелиевых пакетах весом 1 кг (<72 часов) Транспортировка в гелиевых пакетах весом 1 кг (<72 часов) Ночная доставка в замороженных гелиевых пакетах весом 1 кг Сбор в охлажденные пробирки, центрифугирование в холодной центрифуге, замораживание плазмы, транспортировка в ледяной бане Транспортировка в гелиевых пакетах весом 1 кг (<72 часов) Транспортировка в гелиевых пакетах весом 1 кг (<72 часов) Комнатная температура (<7 дней) Комнатная температура (<7 дней) Комнатная температура (<7 дней) Комнатная температура (<7 дней) Комнатная температура (<7 дней) Комнатная температура (<7 дней) Комнатная температура (<7 дней) Комнатная температура 24 часа или < 15 0C 48 часов Ночная доставка в замороженных гелиевых пакетах весом1 кг Транспортировка в гелиевых пакетах весом 1 кг (<72 часов) |
** ЭДТА пробы не рекомендованы для анализа гормонов хемилюминисцентыми методами.
* Известно, что дает ложные результаты, когда для сбора сыворотки используются пробирки для отделения сыворотки, если в лаборатории проводят хемилюминисцентные или ферменные иммунонализы.
Эпизодическая секреция гормонов
|
|
|
Определенное количество гормонов гипофиза высвобождаются эпизодически из-за пульсирующей секреции их релизинг-гормонов гипоталамусом. У многих видов имеются такие циклы, которые длятся около 1-2 часа. Отсюда сбор проб в конце цикла будет давать результаты ниже по сравнению с пробами, собранными от того же животного во время пика цикла. Неправильная оценка функциональной активности надпочечников заключается в том, что у собак предполагают сходный с человеческим суточным циклом высвобождения гормонов (самое низкое во время, когда люди ложатся спать, и самое высокое до того как они встают). На деле высвобождение кортизола у собак следует беспорядочному эпизодическому циклу, который не может быть предсказан, используя информацию об отходе ко сну - вставании утром. Отсюда нет никаких особенностей в сборе пробы в 8 утра или в любое другое время дня; исследование функциональной активности надпочечников может проводиться в любое время.
Глава тридцать четвертая
|
|
|
