1.3. Методы выделения нуклеиновой кислоты

1. 3. Методы выделения нуклеиновой кислоты

Благодаря своей чувствительности и возможности ранней постановки диагноза анализы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), все чаще применяют для выделения лептоспир в тканях и жидкостях животных. Метод ПЦР в реальном времени быстрее обычного метода ПЦР и менее чувствителен к контаминации (Picardeau, 2013). Данные методы можно разделить на две категории в зависимости от того, позволяют ли они выделять гены, которые обязательно присутствуют в бактериях, например, gryB, rrs (16S рРНКген) и secY или гены, характерные для патогенных лептоспир, например, lipL21, lipL32, lipL41, ligA и ligB (Thaipadunpanit et. al., 2011). С помощью таких методов идентифицировать серовар-возбудитель невозможно, хотя некоторые наборы праймеров позволяют провести дополнительную идентификацию до вида или штамма при условии секвенирования ампликонов ПЦР. Такой дополнительный анализ не является стандартным диагностическим методом. Разработано много наборов праймеров для ПЦР, которые прошли оценку для исследования образцов патологического материала, отобранного у человека, а не у животных, и пока по вопросу использования ПЦР праймеров для исследования проб от животных общего понимания не достигнуто, хотя чаще всего упоминаются праймеры на основе гена lipL32. Одним из неразрешенных вопросов, связанных с применением ПЦР в диагностике лептоспироза животных, остается валидация (см. Таблица 1), при этом частные лаборатории отвечают за валидацию только того анализа, который они применяют для исследуемой ткани, жидкости или вида животного. К настоящему времени только три метода ПЦР в реальном времени прошли полную валидацию (Ahmed et. al., 2009; 2012b; Slack et. al., 2007; Thaipadungpanit et. al., 2011). Наличие ингибиторов амплификации в клинических пробах может стать причиной ложноотрицательных результатов, особенно при исследовании таких образцов животных, которые подвержены контаминации испражнениями или повреждены в результате автолиза. При контроле качества методов ПЦР для диагностики лептоспироза необходимо обращать пристальное внимание на дизайн лаборатории и организацию рабочего процесса с точки зрения предотвращения контаминации реагентов и наличия соответствующих контрольных проб (Dragon et. al., 1993; McCreedy & Callawayth, 1993). Кроме того, для ПЦР важное значение имеет обработка проб, которая должна соответствовать исследуемой ткани, жидкости и виду животного.

1. 4. Идентификация изолятов лептоспир

Идентификация изолятов лептоспир – это задача специализированных референтных лабораторий. Для полной идентификации необходимо использовать комбинацию процедур, позволяющих определить: 1) является ли изолят патогеном или сапрофитом; 2) вид Leptospira, к которому принадлежит изолят, и 3) серогруппу и серовар изолята. Принадлежность чистой культуры лептоспир к патогенному или сапрофитному виду определяют с помощью различных тестов: по способности инфицировать животных, относительной резистентности к 8-азагуанину; липазной активности; толерантности к соли и температурной устойчивости (Johnson & Faine, 1984; Johnson & Harris, 1967 ), а также содержанию G + С в ДНК (Johnson & Faine, 1984).

Вид организма определяют с помощью метода ДНК-ДНК гибридизации (Brenner et al., 1999), хотя в последнее время актуальность приобрели другие, более быстрые молекулярные методы (Ahmed et al., 2012a), самым надежным из которых считается мультилокусное типирование-секвенирование (MLST) (Ahmed et al., 2006). Разные изоляты, принадлежащие к одному серовару, почти всегда относятся к одному и тому же виду.

Хотя определение принадлежности штамма Leptospira к определенной серогруппе с помощью реакции перекрестной агглютинации больше не имеет таксономической ценности, данный предварительный этап остается полезным инструментом для идентификации и выбора антигена для вакцин и серологических тестов (Dikken & Kmety, 1978). Дальнейшую дифференциацию до уровня серовара раньше проводили путем перекрестной агглютинации-абсорбции, хотя для большинства изолятов этот процесс теперь выполняют с использованием методов, не требующих такого большого количества времени, например, с применением моноклональных антител (МАТ) (Terpestra et al., 1985; 1987). Многие молекулярных методов могут иметь отношение к серотипированию. Эти методы не подходят для выявления новых сероваров, однако, они могут подсказать направление идентификации и предоставить полезную молекулярно-эпидемиологическую информацию на уровне субсеровара. К таким методам ПЦР относятся мультилокусный анализ тандемных повторов с переменным числом звеньев (Slack et al., 2006; Zuerner & Alt, 2009), амплификация вставочных последовательностей (Zuerner & Bolin, 1995; 1997), полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ) и флуоресцентно-меченный ПДАФ (Vijaychari et al., 2004), а также произвольно праймированная ПЦР (Perolat et al., 1994). Рестрикционный анализ BRENDA оказался очень полезным для эпизоотологического исследования лептоспир сельскохозяйственных животных (Ellis et al., 1991; Thiermann et al., 1986).