2.1.1. Контроль качества антигенов, использованных в РМА

2. 1. 1. Контроль качества антигенов, использованных в РМА

Подлинность антигенов является решающим фактором при проведении реакции микроагглютинации. Подлинность антигенов оценивают с использованием гипериммунных кроличьих сывороток, моноклональных антител или молекулярного метода, подтверждающего пассажи с течением времени, лучше каждый раз, когда проводится тест, но не менее двух раз в год. Гипериммунную кроличью сыворотку для данной цели можно получить из референтной лаборатории или приготовить, следуя протоколу, составленному Подкомитетом по таксономии Leptospira (Международный комитет по систематической бактериологии, 1984 г. ). Вкратце, отбирают здоровых кроликов с массой тела 3-4 кг, у которых отсутствуют обнаруживаемые антитела к лептоспирам. Каждому кролику вводят внутривенно в краевую вену уха хорошо растущую живую или обработанную формалином культуру с плотностью организмов приблизительно 2  108 лептоспир/мл. Возможно, потребуется включить этап промывки, так как альбумин бычьей сыворотки может вызвать шок. Культуру выращивают в среде, содержащей твин 80 и альбумин бычьей сыворотки, или в другой соответствующей среде. Каждому животному вводят пять инъекций по 1, 2, 4, 6 и 6 мл с интервалами в 7 дней. Через неделю после последней инъекции определяют гомологичный титр антител в реакции микроагглютинации. Если титр составляет 1/12800 и более, 7 дней спустя (т. е. через 14 дней после последней инъекции) кролика усыпляют и берут пробу крови посредством пункции сердца. Если титр ниже 1/12800, вводят дополнительную инъекцию культуры в объеме 6 мл; через 7 дней после инъекции снова определяют гомологичный титр. Если величина титра ≥ 1/12800, процедуру повторяют с другим кроликом. Для приготовления одной антисыворотки используют двух кроликов. Если титры у двух кроликов удовлетворительные, сыворотки можно объединить. Для сохранения активности антисыворотку лиофилизируют аликвотами по 2 мл и хранят при 2-5º С. Сыворотку также можно хранить аликвотами по 1 мл при температуре от –15 до − 70º С. Все манипуляции с животными должны быть утверждены и проводиться в соответствии с действующими стандартами по уходу за животными и их использованию. Возможно применение других протоколов иммунизации в зависимости от предполагаемого использования антисыворотки, а также с целью сократить количество используемых кроликов.  

Следует регулярно проверять чистоту антигенов, используемых в реакции микроагглютинации, путем культивирования на кровяном агаре или в тиогликолевом бульоне. Исходные культуры антигенов можно хранить при температуре от –70º C до − 80º C или в жидком азоте. После лиофилизации

выживаемость лептоспир может быть низкой. Повторный пассаж антигенов в жидкой среде приводит к снижению антигенных свойств. В этом случае из исходной культуры получают новую жидкую культуру.

Международное общество изучения лептоспироза3 ежегодно проводит квалификационные испытания по РМА.

3 Доступно на: http: //www. med. monash. edu. au/microbiology/staff/adler/ils. html#Otherinfo

2. 1. 2. Интерпретация результатов и ограничения РМА

Титр 1/100 считается положительным титром для целей международной торговли, но учитывая высокую специфичность РМА, более низкие титры могут свидетельствовать о перенесенной ранее лептоспирозной инфекции.

При исследовании отдельного животного реакция микроагглютинации может быть полезной для диагностики острой инфекции: диагностическим считается выявление четырехкратного изменения в титрах антител в парных образцах сыворотки от животного с острой инфекцией и переболевшего животного. Кроме того, лептоспирозную инфекцию диагностируют в случае обнаружения очень высоких титров у животных с характерной клинической картиной. Данный метод имеет ограничения при диагностике хронической инфекции у отдельных животных, как при исследовании абортированных плодов (Ellis et al., 1982b), так и при выявлении носителей инфекции в почках и половых путях (Ellis, 1986). Это особенно верно в отношении адаптированных к носителю лептоспирозных инфекций, например, при поражении КРС сероваром Hardjo: при значимом титре 1/100 и выше чувствительность теста составляет только 41%, а при снижении минимального значимого титра до 1/10 чувствительность теста составит всего 67% (Ellis, 1986). Выявление антител в крови плода является диагностическим, но титры часто очень низкие, 1/10, то есть в данном случае большинству лабораторий потребуется модифицированная процедура тестирования.

Поскольку лептоспироз является проблемой на уровне всего стада, то реакция микроагглютинации будет намного полезнее в качестве теста для стада. Для получения полезной информации Cole et al. (1980) предложили отбирать образцы, как минимум, у 10 животных или у 10% голов, в зависимости от того, что больше. Во время изучения инфекции сероваром Hardjo у КРС, Hathaway et al. (1986) обнаружили, что исследование образцов от 10 коров обычно позволяет установить наличие или отсутствие инфекции в стаде. Увеличение объема выборки может существенно повысить качество эпизоотологических данных, исследования клинической формы болезни и результатов отслеживания источника инфекции органами здравоохранения.

Серологическая диагностика лептоспироза должна осуществляться с учетом серовара-возбудителя и клинической картины. В случае абортов у КРС, вызванных заражением сероваром Pomona, высокие титры обычно обнаруживают во время абортирования, поскольку это событие происходит относительно скоро после заражения. Абортирование у КРС вследствие заражения сероваром Hardjo является хроническим явлением; в этом случае серологический ответ на момент аборта может быть существенно варьировать: то есть у некоторых животных антитела будут отсутствовать, а у других будут

наблюдаются высокие титры антител. Во время острой фазы заражения сероваром Hardjo у КРС может наблюдаться снижение надоев, и данный клинический признак ассоциируется с наличием высоких титров. При интерпретации результатов реакции микроагглютинации следует также учитывать историю вакцинации, поскольку широко применяемая вакцинация в значительной мере обуславливает присутствие большого количества сероположительных животных и может маскировать наличие хронической инфекции в стаде, особенно при заражении сероваром Hardjo.