 |
2. Серологические тесты. 2.1. Реакция микроагглютинации. 2.1.1. Процедура исследования
|
|
|
|
2. Серологические тесты
Серологическое исследование – лабораторная процедура, наиболее часто используемая для подтверждения клинического диагноза, для определения превалентности инфекции в стаде и для проведения эпизоотологических исследований. Антитела к лептоспирам появляются в течение нескольких дней после возникновения заболевания и сохраняются в течение нескольких недель или месяцев, а в некоторых случаях и лет. К сожалению, при хронической инфекции титры антител могут падать до необнаруживаемого уровня. Для решения данной проблемы необходимы чувствительные методы обнаружения организма в моче или половых путях хронических носителей.
Описано большое количество различных серологических тестов с разной степенью специфичности по отношению к серогруппам и сероварам. Для ветеринарной диагностики имеют значение два теста: реакция микроагглютинации (РМА) и твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).
2. 1. Реакция микроагглютинации
Наиболее широко используемым серологическим тестом является реакция микроагглютинации с использованием живых антигенов. Это референтный метод, который применяется для сравнительной оценки других серологических тестов и для тестирования при импорте/экспорте. Для достижения оптимальной
чувствительности необходимо использовать антигены, репрезентативные для всех серогрупп, существующих в регионе, в котором выявлены зараженные животные, и лучше использовать штаммы, представляющие все известные серогруппы. На присутствие серогруппы обычно указывает частая реакция в серологическом скрининге, хотя точно ее можно определить только путем выделения серовара у клинически пораженных животных. Чувствительность теста можно повысить за счет использования местных изолятов, а не справочных штаммов, однако справочные штаммы помогают при интерпретации результатов между лабораториями.
|
|
|
Реакции микроагглютинации характеризуются хорошей специфичностью, как правило, антитела к другим бактериям не вступают в выраженную перекрестную реакцию с антителами к Leptospira. Однако между сероварами и серогруппами Leptospira существует значительная серологическая перекрестная реактивность, и животное, инфицированное одним сероваром, по всей вероятности, будет иметь антитела против серовара-возбудителя, а также показывать реакцию (обычно с более низкими титрами) к другим сероварам в реакции микроагглютинации. Следовательно, с помощью серологической реакции невозможно с точностью определить серовар-возбудитель в случае отдельной инфекции или вспышки – для этого требуется выделение возбудителя. Однако в областях, в которых присутствующие серовары Leptospira хорошо описаны в исследованиях с выделением патогена, результаты серологического исследования инфицированного животного могут указать, но не точно идентифицировать серовар-возбудитель. Кроме того, у животных, ранее вакцинированных против лептоспироза, могут быть антитела к сероварам, присутствующим в вакцине. В связи с этим, крайне важно учитывать историю вакцинации тестируемых животных. Два способа проведения данного исследования подробно описаны (Faine et al., 2000; USDA, 1987).
2. 1. 1. Процедура исследования
i i) Отобранные штаммы выращивают в жидкой среде для культивирования лептоспир (например, EMJH или в другой подходящей среде) при 29±1º C, возраст культуры должен составлять, как минимум 4 дня, но не более 8 дней. В качестве антигенов используют живые культуры с плотностью лептоспир около 2 108 на мл. Плотность культуры можно определить прямым подсчетом клеток в камере для подсчета бактерий и темнопольного микроскопа. Иным образом количество клеток можно определить путем измерения коэффициента пропускания с использованием спектрофотометра с фильтром 400 нм или нефелометра. В случае применения непрямых методов, количество бактериальных клеток, подсчитанное прямым способом, должно коррелировать с результатами, полученными с использованием специального оборудования.
|
|
|
i ii) Определяют необходимое количество антигенов и проводят скрининговый тест с разведением сыворотки 1/50 (или другого стартового разведения, исходя из цели теста).
i iii) В каждую лунку добавляют каждый антиген в объеме, равном объему разведенной сыворотки, то есть конечное разведение сыворотки в скрининговом тесте становится 1/100.
i iv) Титрационные микропланшеты инкубируют при 30±1º C в течение 1, 5-4 часов.
i v) Планшеты изучают под темнопольным микроскопом.
Конечной точкой считают разведение сыворотки, при котором наблюдается 50% агглютинация при 50% свободных клеток по сравнению с контрольной культурой, разведенной ½ в фосфатно-буферном растворе. Результат теста записывают в виде конечного разведения сыворотки (например, 1/100 или 1/400) или в виде титра, который представляет собой обратный показатель конечного разведения сыворотки (например, 100 или 400).
|
|
|
