 |
Химический анализ ЛРС, содержащего кумарины
|
|
|
|
Задание 1. Выделите кумарины из предложенного образца лекарственного растительного сырья для проведения качественных реакций и хро матографического анализа.
Методика. 3, 0 г сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, помещают в колбу со шлифом вместимос-тью 100 мл, прибавляют 30 мл 95 %-ного спирта и нагревают на кипящей водя-ной бане с обратным холодильником в течение 20 мин. Извлечение фильтруют
в горячем виде и к фильтрату добавляют по каплям при постоянном перемеши-вании 10 %-ный раствор свинца ацетата. При этом бо′ льшая часть веществ фе-нольного характера, обладающая способностью к азосочетанию, осаждается. Еще горячую массу переносят на фильтр, отделяют осадок солей свинца и промы-вают осадок 3 мл спирта. К охлажденному фильтрату прибавляют 5 мл воды.
Для дальнейшей очистки фильтрат помещают в делительную воронку вместимостью 100 мл, приливают 20 мл хлороформа и встряхивают. Отделя-ют нижний хлороформный слой. Хлороформ отгоняют под вакуумом, а оста-ток в колбе растворяют в 6 мл 95 %-ного спирта. Этот раствор используют для дальнейшего анализа.
Задание 2. Проведите качественные реакции обнаружения кумаринов
в полученном извлечении. Запишите наблюдения, химизм реакций и заключение
в лабораторный журнал.
Опыт 1. Лактонная проба. К 2 мл спиртового извлечения прибавляют
5 капель 10 %-ного спиртового раствора калия гидроксида, нагревают на во-дяной бане в течение 5 мин (при наличии кумаринов раствор желтеет). Со-держимое пробирки охлаждают, добавляют 2 мл очищенной воды, хорошо перемешивают, прибавляют 10 %-ный раствор хлористоводородной кислоты до кислой реакции (по лакмусу).
|
|
|
Возникновение опалесценции, помутнение или образование осадка ука-зывает на возможное присутствие кумаринов в сырье.
Реакция основана на способности кумаринов при нагревании в щелоч-ной среде образовывать соли желтого цвета, растворимые в воде. При под-кислении раствора образуется кислота кумариновая, которая, замыкаясь, переходит в исходные кумарины, не растворимые в воде:
Опыт 2. Реакция с диазореактивом в щелочной среде. К 2 мл спиртового извлечения прибавляют 5 капель 10 %-ного спиртового раствора калия гидроксида и нагревают на водяной бане в течение 3—5 мин, прибавляют 5 капель свежеприготовленной диазотированной кислоты сульфаниловой.
При наличии кумаринов раствор приобретает коричнево-красную или вишневую окраску.
Реакция основана на способности кумаринов образовывать окрашенные продукты с ароматическими аминопроизводными:
1 0 0 Фенольные соединения. Тема 5. Кумарины
Реактив. 0, 45 г кислоты сульфаниловой помещают в мерную колбу вместимос-тью 50 мл, прибавляют 4, 5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной, растворяют в 40 мл воды, доводят объем раствора водой до метки. Срок хранения раствора — 1 месяц.
5 мл раствора кислоты сульфаниловой помещают в мерную колбу вместимостью
100 мл, поставленную на лед, прибавляют 2, 5 мл 10 %-ного раствора натрия нитрита. Смесь оставляют на льду в течение 5 мин, прибавляют еще 10 мл раствора натрия нитрита и снова оставляют на ледяной бане на 5 мин, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Реактив используют свежеприготовленным и сохраняют на ледяной бане в течение анализа.
Задание 3. Идентифицируйте кумарины методом хроматографии в тонкомслое сорбента в сравнении со стандартыми образцами кумаринов. Зарисуйте схему хроматограммы и рассчитайте величины Rf кумаринов. Сделайте заключе ние о качественном составе кумаринов в экстракте.
|
|
|
Сравните полученные вами результаты с типовой хроматограммой, пред-ставленной на цв. вкл. IV, рис. 1.
Методика. Спиртовый раствор (см. задание 1) и растворы стандартных образцов кумаринов наносят капилляром на линию старта пластинки, по-крытой слоем силикагеля. Пластинку сушат на воздухе в течение 5 мин, затем помещают в камеру со смесью растворителей гексан-ацетон (8: 2) или бензол-этилацетат (2: 1) и хроматографируют восходящим методом. Кума-рины в зависимости от структуры имеют в УФ-свете зеленую, ярко-голу-бую, зеленовато-голубую или фиолетовую флуоресценцию, которая усили-вается под действием щелочи (обычно хроматограмму выдерживают в парах аммиака).
Отмечают пятна кумаринов и цвет их флуоресценции на пластинке про-стым карандашом. Хроматограмму опрыскивают 10 %-ным спиртовым раство-ром калия (натрия) гидроксида, подсушивают в сушильном шкафу при тем-пературе 110—120 °С в течение 2—3 мин, а затем опрыскивают свежеприго-товленным раствором кислоты сульфаниловой диазотированной.
При наличии кумаринов в сырье на хроматограмме появляются яркие пятна от красного до фиолетового цвета.
Задание 4. Определите количество кумаринов в листьях смоковницы обыкновенной. Рассчитайте результат и сделайте заключение о соответствии иссле дуемого сырья требованиям ФС 424—99 — «не менее 0, 08 % суммы кумаринов в пересчете на псорален».
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.
Около 3 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в аппарат Сокслета и экстрагируют смесью растворителей метанол—хлороформ (15: 85)
в течение 2—3 ч (не менее 15 сливов). Последний слив растворителя должен быть практически бесцветным.
Полученный экстракт упаривают до объема 80—90 мл, охлаждают до ком-натной температуры, количественно переносят в мерную колбу вместимос-тью 100 мл, доводят объем раствора до метки смесью растворителей мета-нол—хлороформ (15: 85) и перемешивают.
20 мл полученного раствора помещают в делительную воронку вмести-мостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды, затем — 2 г натрия хлорида. Смесь энергично встряхивают в течение 2 мин и дают отстояться до полного разде-ления фаз. Верхний, водный, слой переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, а хлороформно-метанольный слой вновь обрабатывают 40 мл воды
|
|
|
| Макро и микроскопический анализ ЛРС, содержащего кумарины | 1 0 1 | |
с добавлением 2 г натрия хлорида, как описано выше. После расслоения фаз водную часть переносят в ту же мерную колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Полученный раствор центрифугируют (5000 об/мин) в течение 5 мин, после чего фильтруют через бумажный фильтр «желтая лента».
Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофото-метре при длине волны 290 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения воду.
Содержание суммы кумаринов Х, %, в пересчете на псорален и высушен-ное сырье вычисляют по формуле
| D · 100 · 100 · 10 | D · 500 · 100 |
Х = ————————————— = ———————————,
650 · m · 20 · (100 – W ) 650 · m · (100 – W )
где D — оптическая плотность испытуемого раствора при 290 нм; 650 — удельный показатель поглощения псоралена при 290 нм; m — масса навески сырья, г;
W — содержание влаги в сырье, %.
|
|
|
