 |
Методическое пособие. Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний. Содержание. Введение. 1. Общая характеристика нуклеиновых кислот
|
|
|
|
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского»
Медицинская академия имени С. И. Георгиевского
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Методическое пособие
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Симферополь, 2020
Методическое пособие предназначено для студентов медицинских вузов - код направления подготовки 30. 00. 00 Фундаментальная медицина - по специальности «Лечебное дело», «Педиатрия», «Стоматология», «Фармация». В пособии изложены основные принципы современных молекулярно-генетических методов диагностики возбудителей инфекционных заболеваний. Представленный материал содержит большое количество иллюстративного материала.
Авторы:
Хайтович А. Б. – доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии 2 медицинского факультета Медицинской академии имени С. И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского»;
Ткач А. В. – студент 3-го курса 1 медицинского факультета Медицинской академии имени С. И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского».
Рецензенты:
Ермола Ю. А. – кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической анатомии с секционным курсом Медицинской академии имени С. И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского»;
Абдурашитов С. Ф. – кандидат биологических наук, заведующий лабораторией ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма».
СОДЕРЖАНИЕ
| Введение…………………………………………………………………………….. | |
| 1. Общая характеристика нуклеиновых кислот…………………………………... 2. Строение генетического материла бактерий, вирусов …. ……………………... 3. Молекулярно-генетические методы в лабораторной диагностике различных микроорганизмов …………………………………………………………………… 3. 1. Рестрикционный анализ……………………………………………………….. 3. 2. Метод молекулярной гибридизации………………………………………….. | |
| 3. 3. Полимеразная цепная реакция ………………………………….. ………….. | |
| 3. 3. 1. Принцип метода ПЦР……………………………………………. ………….. | |
| 3. 3. 2. Организация ПЦР-лаборатории и необходимое оборудование. ………….. | |
| 3. 3. 3. Этапы ПЦР……………………………………………………….. …………... | |
| 3. 3. 4. Виды ПЦР…………………………………………………………………….. | |
| 3. 3. 5. Преимущества и недостатки ПЦР…………………………………………… | |
| 3. 4. Лигазная цепная реакция …………………………………………. ………….. 3. 5. LAMP- реакция …………………………………………………....... ………... 3. 6. Биологическое микрочипирование…………………………………………… 3. 7. Метод сравнения геномов по составу основания ДНК……………………… 3. 8. Метод генных зондов………………………………………………………….. 3. 9. Секвенирование ДНК………………………………………………………… 3. 10. Плазмидный профиль…………………………………………………………. 3. 11. Риботипирование и опосредованная транскрипцией амплификация рибосомальной РНК………………………………………………………………… 3. 12. Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК………. …………… 4. Заключение……………………………………………………………………….. Список литературы……………………………………………………. …………… | |
Введение
|
|
|
Современная медицина успешно использует достижения естественных наук, интенсивно применяет новые технологии для диагностики и лечения заболеваний. В последнее время к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий, задачей которых является обнаружение в исследуемом материале фрагментов ДНК/РНК микроорганизмов.
|
|
|
Молекулярно-генетические методы диагностики позволяют определить нуклеиновую кислоту микроорганизма в клеточном материале, и как результат – быстро и точно поставить диагноз. Высокая чувствительность и специфичность этих методов с каждым годом делает их всё более востребованными в практической лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний.
В настоящее время актуальным является применение ПЦР–диагностики для выявления носительства РНК SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV и подобных вирусов, ассоциированных с тяжелой респираторной коронавирусной инфекцией. Важно, что при проведении этого метода диагностики не требуются манипуляции с живыми вирусными культурами, что предотвращает распространение и циркуляцию вирусов внутри лечебно-диагностических и лабораторных учреждений.
1. Общая характеристика нуклеиновых кислот
Структуру нуклеиновых кислот впервые установили американский биохимик Дж. Уотсон и английский физик Ф. Крик. Изучение этих соединений имеет важное значение для понимания наследования признаков у организмов и закономерностей функционирования отдельных клеток и клеточных систем – тканей и органов.
Нуклеиновые кислоты - гетерополимеры, их мономерами являются мононуклеотиды. В состав мононуклеотида входит пуриновое или пиримидиновое азотистое основание, пентоза и остаток фосфорной кислоты. К пуриновым основаниям относят аденин и гуанин, к пиримидиновым - цитозин, тимин и урацил.
Существуют два различных типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК). ДНК представляет собой генетический материал организмов. В прокариотипических клетках, кроме основной хромосомной ДНК (нуклеоид, генофор), часто встречаются внехромосомные ДНК – плазмиды и другие генетические структуры – транспозоны, инсертициальные элементы, интегроны, островки патогенности. В эукариотических клетках основная масса ДНК расположена в клеточном ядре, где она связана с различными белками в хромосомах, а также содержится в органеллах – митохондриях и пластидах.
|
|
|
ДНК – это линейный, нерегулярный биологический полимер, состоящий из двух полинуклеотидных цепей, соединенных друг с другом. РНК так же, как ДНК, представляет собой полимер, мономерами которого являются нуклеотиды. Азотистые основания трех нуклеотидов те же самые, что входят в состав ДНК (аденин, гуанин, цитозин), четвертое — урацил — присутствует в молекуле РНК вместо тимина. Нуклеотиды РНК отличаются от нуклеотидов ДНК и по строению входящего в их состав углевода: они включают другую пентозу - рибозу (рис. 1).
Рис. 1. Строение нуклеиновых кислот
[File: Difference DNA RNA-EN. svg]
РНК переносят информацию о последовательности аминокислот в белках, т. е. о структуре белков, от хромосом к месту их синтеза, и участвуют в синтезе белков. По структуре различают двухцепочечные и одноцепочечные РНК. Двухцепочечные РНК — хранители генетической информации у ряда вирусов, т. е. выполняют у них функции носителей наследственной информации (так называемые РНК-содержащие вирусы).
Существует несколько видов одноцепочечных РНК. Их названия обусловлены выполняемой функцией или местонахождением в клетке. Большую часть цитоплазмы (до 80-90%) составляет рибосомалъная РНК (рРНК), содержащаяся в рибосомах. Молекулы рРНК относительно невелики и состоят из 3-5 тыс. нуклеотидов. Другой вид - информационные (иРНК), или матричные РНК (мРНК), переносящие к рибосомам информацию о последовательности аминокислот в белках, которые должны синтезироваться. Размер этих РНК зависит от длины участка ДНК, на котором они синтезированы. Молекулы иРНК состоят из нуклеотидов. Транспортные РНК (тРНК) включают 76-85 нуклеотидов и выполняют несколько функций. Они доставляют аминокислоты к месту синтеза белка, «узнают» (по принципу комплементарности) триплет иРНК, соответствующий переносимой аминокислоте, осуществляют точную ориентацию аминокислоты на рибосоме [1].
|
|
|
