 |
3.10. Плазмидное типирование. 3.11. Риботипирование и опосредованная транскрипцией амплификация рибосомальной РНК. 3.12. Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК
|
|
|
|
3. 10. Плазмидное типирование
Плазмидное типирование - метод, основанные на изучении фрагментов ДНК. При помощи специальных методов из бактерий выделяют плазмидную ДНК и проводят разделение плазмид в агарозном геле.
Плазмиды – это внехромосомные генетические элементы, несущие генетическую информацию, функционирующие и реплицирующиеся независимо от генетического аппарата клетки-хозяина; не связаны с остальными функциями клетки. Анализ плазмидного профиля позволяет выявить генетическое разнообразие и является информативным методом внутривидовой дифференциации.
Сущность плазмидного анализа заключается в изучении спектра плазмид у штаммов возбудителей инфекционных болезней, с последующим определением степени гомологии плазмидных ДНК штаммов при помощи рестрикционного анализа.
Для изучения плазмидного профиля исследуемых штаммов, проводится электрофорез выделенной и очищенной ДНК в агарозном геле. Гель электрофорез позволяет установить количество содержащихся в исследуемых штаммах плазмид и довольно точно определить их размеры (молекулярную массу).
Перед проведением электрофореза плазмидную ДНК можно обработать рестриктазами, что приводит к фрагментированию ДНК. Метод позволяет оценить количество плазмид, их размер, а также характер образуемых рестрикционных фрагментов.
Плазмидный анализ широко используется в эпидемиологических исследованиях, особенно при расследовании вспышек заболеваний, вызванных такими микроорганизмами, как Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, представителями семейства Enterobacteriaceae. Однако многие клинические штаммы способны терять плазмиды, особенно в процессе многочисленных пересевов в лаборатории [4].
|
|
|
3. 11. Риботипирование и опосредованная транскрипцией амплификация рибосомальной РНК
Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах, кодирующих рРНК, отличается консервативностью, присущей каждому виду бактерий. Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких копиях. Фрагменты ДНК, полученные после обработки ее рестриктазами, содержат последовательности генов рРНК, которые могут быть обнаружены методом молекулярной гибридизации с меченой рРНК соответствующего виды бактерий. Количество и локализация копий оперонов рРНК и рестрикционный состав сайтов как внутри рРНК-оперона, так и по его флангам варьируют у различных видов бактерий. На основе этого свойства построен метод риботипирования, который позволяет производить мониторинг выделенных штаммов и определение их вида. В настоящее время риботипирование проводится в автоматическом режиме в специальных приборах.
3. 12. Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК
Метод используется для диагностики смешанных инфекций. Этот метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гибридизации амплифицированных рРНК, специфичных для определенного вида бактерий.
Исследование проводится в три этапа:
1 этап - амплификация пула рРНК на матрице выделенной из исследуемого материала ДНК при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы;
2 этап - гибридизация накопленного пула рРНК с комплементарными видоспецифическими рРНК олигонуклеотидами, меченными флюорохромом или ферментами;
3 этап - определение продуктов гибридизации методами денситометрии, иммуноферментного анализа (ИФА).
Реакция проводится в автоматическом режиме в установках, в которых одномоментное определение рРНК, принадлежащих различным видам бактерий, достигается разделением амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносятся комплементарные видоспецифическим рРНК меченые олигонуклеотиды для гибридизации.
|
|
|
4. Заключение.
В представленном пособии рассмотрены основные молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний. Настоящее учебное пособие дает общие представления о методологии и стратегии проведения молекулярно-генетической диагностики, раскрывает методы, наиболее часто используемые в практике современного исследователя.
Список литературы
1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир. — 2002. — С. 589.
2. Молекулярная биология бактерий: учеб. -метод. пособие / В. В. Слизень, Л. П. Титов. – Минск: БГМУ, 2007. – 48 с.
3. Вирусология: практическое пособие для студентов: в 2 частях. Ч. 1 / Л. В. Шевцова; Гомель: ГГУ им. Ф. Скорины, 2010. – 58 с.
4. Методы исследования в микробиологии: учеб. -метод. пособие/ Ж. Г. Шабан, В. В. Слизень, Т. А. Канашкова, И. А. Крылов С – Минск: БГМУ, 2010. - 124 с. URI http: //rep. bsmu. by/handle/BSMU/3306
5. Маккреди Б. Дж., Чимера, Д. А. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. - М.: Мир, 1999. - C. 496 – 506.
6. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985. —Т. 230. —№4732 —Р. 1350–1354.
7. Зорина В. В. Основы полимеразной цепной реакции. М., 2012. – 76 с.
8. Молочков В. А., Кириченко И. М., Кривошеин Ю. С., Хайтович А. Б., Латыпова М. Ф., Несвижский Ю. В., Смирнов И. В., Щербо С. Н. Под редакцией акад. А. А. Воробьева Полимеразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматовенерологии / МИА. – Москва – 2004. – 71 с.
9. Чухловин А. Б. Клиническая значимость молекулярно-биологической диагностики // Ученые записки СПбГМУ. — 2010. — Т. 17, № 1. — С. 62–68.
10. Методические указания (МУ 1. 3. 1794-03) «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. Москва, 2003. – 38 с.
11. Методические указания (МУ 1. 3. 2569–09) «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности». Москва, 2009. – 31 с.
|
|
|
12. Антонова, О. С. Эффективные методы выделения нуклеиновых кислот для проведения анализов в молекулярной биологии (обзор) / О. С. Антонова, Н. А. Корнева, Ю. В. Белов // Научное приборостроение. – 2010. – Т. 20, № 1. – С. 3–9.
13. Ребриков Д. В., Саматов Г. А., Трофимов Д. Ю. и др. ПЦР «в реальном времени». — М: БИНОМ. Лаборатория Знаний, 2009. — 223 с.
14. Молекулярные механизмы генетических процессов: методы изучения геномов: методическое пособие / Д. А. Каспирович, Н. А. Глинская, Е. М. Волкова. – Пинск: ПолесГУ, 2015. – 52 с.
15. Четина Е. В., Грижебовский Г. М., Брюханов А. Ф., Хайтович А. Б., Курбанов Ш. Х., Гинцбург А. Л. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae O1) / Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - М. – 1993. - № 6. - С. 18-22.
16. Андроновская И. Б., Кириченко И. М., Несвижский Ю. В., Смирнов И. В., Хайтович А. Б. Полимеразная цепная реакция и ее применение в диагностике инфекционных заболеваний – учебно-методическое пособие / Москва. - 2003. – 65 с.
17. Жумина А. Г. Петлевая изотермическая амплификация нуклеиновых кислот: принцип и применение. Серия «Биология. Медицина. География». № 3(79)/2015: 37-43.
18. https: //www. skygen. com/podderzhka/obzory/28_izotermicheskaya_amplifikatsiya_resheniya_ot_new_england_biolabs/
19. Мызникова А. И., Файзуллин Л. З., Захарова Н. В. и др. Олигонуклеотидные биочипы в диагностике неонатальных вирусных инфекций. Вопросы практ. педиатрии. 2006. —№1. — С. 61–64.
20. Грядунов Д. А., Зименков Д. В., Михайлович В. М. и др. Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в медицинской лабораторной диагностике // Медицинский алфавит. 2009. —№ 3. —С. 10–14.
|
|
|
