3.4. Лигазная цепная реакция

Лигазная цепная реакция (ЛЦР) - ферментативная реакция, осуществляемая in vitro с помощью термостабильной ДНК-лигазы на матрице ДНК с использованием двух олигонуклеотидных ДНК-затравок, комплементарных нуклеотидной последовательности ДНК-мишени. Если мишень присутствует в анализируемом образце ДНК, олигонуклеотиды-затравки гибридизуются с ней, и лигаза осуществляет их ковалентное связывание. После денатурации с помощью повышения температуры цикл реакции повторяется. При каждом последующем цикле происходит удвоение количества гибридных олигонуклеотидов. Лигазная цепная реакция используется для выявления и амплификации определенных нуклеотидных последовательностей и мутаций в ДНК; впервые описана Ф. Барани в 1991 г.

При проведении лигазной цепной реакции используется способность ДНК-лигаз восстанавливать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах двухцепочечных молекул ДНК. Для этого синтезируют два олигонуклеотида, комплементарные непрерывной последовательности нуклеотидов ДНК, которые после гибридизации с такой последовательностью примыкают друг к другу и разделены лишь одноцепочечным разрывом. При этом 3'-конец предшествующего нуклеотида должен содержать свободную 3'-ОН-группу, а в 5'- положении 5'-конца олигонуклеотида, следующего за ним, должна находиться фосфатная группа (рис. 19).

В первом цикле ЛЦР эти два олигонуклеотида отжигаются с исследуемой денатурированной ДНК (как и при ПЦР) в присутствии термостабильной ДНК-лигазы. Реакционную смесь прогревают до температуры, оптимальной для лигирования, после чего между отожженными олигонуклеотидами образуется фосфодиэфирная связь. Затем температуру реакционной смеси повышают до температуры плавления гибрида.

Во втором цикле температуру реакционной смеси понижают до температуры отжига олигонуклеотидов, которые, находясь в молярном избытке по отношению к освободившимся продуктам реакции, преимущественно гибридизуются с анализируемой ДНК. Далее связавшиеся олигонуклеотиды снова лигируют, и образовавшийся продукт реакции освобождают из гибрида повышением температуры. При этом содержание продукта в реакционной смеси удваивается.

После проведения n циклов ЛЦР в реакционной смеси теоретически может оказаться nx молекул продукта реакции, где х - число пар олигонуклеотидов, вступающих в реакцию в каждом цикле, теоретически равное числу копий анализируемой последовательности нуклеотидов в реакционной смеси.

ЛЦР не происходит, если 3'-концевой нуклеотид первого олигонуклеотида или 5'-концевой нуклеотид второго некомплементарны соответствующим нуклеотидам анализируемой ДНК. Поэтому при наличии мутации в тех сайтах ДНК, где олигонуклеотиды стыкуются друг с другом, в реакцию со своим партнером вступает только измененный олигонуклеотид, полностью комплементарный анализируемой мутантной ДНК, т. е. продукт реакции образуется лишь при наличии в реакционной смеси " мутантного" олигонуклеотида, но не олигонуклеотида дикого типа.

Принципы, лежащие в основе метода определения мутаций с помощью ЛЦР, сходны с принципами аллель-специфической ПЦР.

.

Рис. 19. Схема ЛЦР

[http: //molbiol. edu. ru/review/04_0305.gif]

Для количественной оценки ЛЦР один из олигонуклеотидов обычно метят биотином, а другой (соответствующий мутантному аллелю) - радиоактивной или флуоресцентной меткой. По завершении ЛЦР олигонуклеотиды, меченные биотином, связывают с мембранными фильтрами с иммобилизованным стрептавидином, а количество лигированных олигонуклеотидов определяют по количеству связавшейся с фильтрами радиоактивной или флуоресцентной метки после отмывки непрореагировавших олигонуклеотидов.

Отличия ЛЦР от ПЦР

ЛЦР проводится по принципу, аналогичному ПЦР, но вместо Taq-полимеразы и dNTP используется термостабильная ДНК-лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к амплифицируемому фрагменту ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу; одновременно они комплементарны и другой паре олигонуклеотидов.

На одной молекуле-матрице за 30 мин может быть синтезировано до 1 млрд. копий, то есть количественный выход ЛЦР значительно выше. Специфичность ЛЦР в отношении однонуклеотидных замен выше, чем у ПЦР.

Высокая скорость протекания реакции имеет значение для проведения экспресс-диагностики, например, при определении степени облучения лиц, подвергшихся радиационному облучению.