 |
3.6. Биологическое микрочипирование
|
|
|
|
3. 6. Биологическое микрочипирование
Биологические микрочипы - одно из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии. Представляют собой совокупность ячеек, расположенных на поверхности стекла или пластика, являясь миниатюрным аналогом нескольких сотен и даже тысяч реакционных пробирок.
Рис. 21. Принцип работы биочипов
[https: //konspekta. net/studopedianet/baza6/288931922070.files/image002.gif]
На матрице-подложке биочипа расположено множество ячеек с гидрогелем (диаметр ячейки около 100 мкм, на одном квадратном сантиметре размещается до тысячи ячеек). В ячейках содержатся молекулы-зонды (фрагменты ДНК, РНК, белки). Каждая ячейка является аналогом микропробирки, в которой происходит реакция между молекулами-зондами и молекулами исследуемой пробы. Если эти молекулы подходят друг к другу как ключ к замку, происходит гибридизация - соединение молекул с помощью химических связей. Ячейка, в которой произошла реакция, флуоресцирует, потому что пробу предварительно обрабатывают светящейся меткой (рис. 21). В специальном приборе-анализаторе (" чип-детектор" ) конфигурация светящихся точек покажет наличие бактерий и вирусов, выявит генетические формы микроорганизмов – возбудителей болезни. В настоящее время выпускаются биочипы для выявления вирусов гриппа типа А (в том числе вируса птичьего гриппа), герпеса, гепатита В и С, возбудителей сибирской язвы, оспы, чумы, бруцеллёза, разнообразных инфекций у беременных женщин и новорожденных. Разрешены к применению в медицинской лабораторной практике тест-системы, для определения чувствительность возбудителя туберкулёза к лекарственным препаратам [19, 20].
|
|
|
3. 7. Метод сравнения геномов по составу основания ДНК
Поскольку число водородных связей между основаниями в парах ГЦ больше, чем между основаниями в парах AT, о ГЦ-содержании судят по «температуре плавления» ДНК, т. е. по температуре, при которой происходит разрыв водородных связей, соединяющих цепи ДНК. Разделению цепей сопутствует увеличение оптической плотности, которую измеряют спектрофотометром при А = 260 нм (максимум поглощения ДНК). По мере нагревания образца ДНК поглощение возрастает, а когда ДНК становится одноцепочечной, кривая поглощения достигает плато.
ДНК каждого вида бактерий содержит характерное среднее количество ГЦ, и если нуклеотидный состав ДНК у двух сравниваемых микроорганизмов существенно отличается (10 – 15%), то это свидетельствует об их принадлежности к различным таксономическим группам. Однако отсутствие существенных отличий в количестве ГЦ у двух видов бактерий недостаточно для заключения о тождестве этих бактерий: необходимо доказать высокое фенотипическое сходство обоих видов или применить другие генетические методы.
3. 8. Метод генных зондов
Этот метод используют для идентификации бактерий. От обычной ДНК гибридизации этот способ отличается использованием не тотальной ДНК, а ее определенного фрагмента (зонда), содержащего известный ген (генетический маркер). Предварительно создают «банк генов» изучаемой бактерии. С этой целью бактериальную ДНК расщепляют эндонуклеазами, фрагменты ДНК разделяют электрофоретически, методом трансформации определяют их генетические характеристики, отбирают нужный фрагмент ДНК и при помощи лигазы включают в плазмиду, которая служит вектором. Плазмиду с интегрированным известным геном вводят в какой-либо бактериальный штамм, обычно достаточно легко культивируемый. Получают большое количество биомассы, содержащей ДНК-зонд. Выделяют плазмидную ДНК, метят ее радиоактивным изотопом, а затем гибридизируют с ДНК изучаемой бактерии. Методом ауторадиографии выявляют относительную частоту гибридизации маркера с изучаемой ДНК и по этому показателю судят о генетическом родстве известной (бактерии – донора ДНК) и исследуемой бактерий.
|
|
|
3. 9. Секвенирование ДНК
Секвенирование ДНК - определение нуклеотидной последовательности. В настоящее время разработаны методы определения полной нуклеотидной последовательности любой молекулы ДНК. При решении этой задачи необходимо иметь большое количество идентичных фрагментов молекул ДНК. Наработку интересующих последовательностей можно осуществить клонированием соответствующего фрагмента, например, методом ПЦР. Метод секвенирования по Максаму - Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию.
Другой ферментативный метод (метод Сэнгера) базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. Секвенирование позволяет определить полную нуклеотидную последовательность всех хромосом, всего ДНК любого генома, любого организма. Это уже почти полностью сделано для некоторых бактерий, мухи дрозофилы, мыши и человека. Кроме того, этот метод позволяет определить последовательность нуклеотидов любых генов, что дает возможность их синтеза.
|
|
|
