3.5. LAMP-реакция

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) является новым методом амплификации нуклеиновых кислот, который был разработан Tsugunori Notomi и его коллегами в 2000 г. Сущность метода заключается в удвоении участка ДНК с высокой специфичностью, эффективностью и скоростью в условиях постоянной температуры. При совмещении с обратной транскрипцией LAMP может с высокой эффективностью амплифицировать РНК последовательности. Данный метод основан на автоматическом цикле синтеза ДНК цепи со смещением при использовании ДНК-полимераз с высокой активностью смещения и четырех (шести) специально созданных праймеров.

Четыре праймера сконструированы таким образом, чтобы быть нацеленными на шесть определенных регионов гена-мишени. Последние обозначаются как F3c, F2c и F1c на 3'-конце и В1с, В2с и В3с на 5'-конце (рис. 20).

Рис. 20 Строение праймеров для LAMP

[https: //www. skygen. com/upload/medialibrary/6b1/6b16eef43b7922ab79acfddc261be532.png]

Различают внешние (Outer) и внутренние (Inner) праймеры. Первый внешний праймер F3 (Forward Outer Primer) состоит из F3 региона, который комплементарен F3c фрагменту гена-мишени. Второй внешний праймер В3 (Backward Outer Primer) состоит из В3 региона, который комплементарен В3с участку гена-мишени. Третий праймер — внутренний FIP (Forward Inner Primer) содержит F2 фрагмент на 3'-конце, который комплементарен F2c, а также такую же последовательность, как и F1c регион ДНК мишени на 5'-конце. Четвертый праймер BIP Backward Inner Primer также является внутренним и состоит из региона В2 на 3'-конце и такой же последовательности, как и В 1с регион на 5'-конце.

В LAMP-реакции различают три этапа:

1 этап - синтез начального материала (starting material producing step);

2 этап - циклическая амплификация (cycling amplification step);

3 этап - элонгация и рециклирование (elongation and recycling step).

Реакция протекает в изотермических условиях, так как денатурация цепей происходит за счет их смещения. Сама реакция инициируется внутренними праймерами, содержащими смысловые и бессмысленные последовательности ДНК мишени. При температуре 60 °С F2 регион внутреннего праймера FIP гибридизируется с мишенью, и цепь достраивается с помощью ДНК-полимеразы. Затем внешний праймер F3 присоединяется к F3с фрагменту мишени, и полимераза достраивает цепь, при этом смещая только что синтезированную последовательность. Смещенная цепь формирует петлеобразные структуры на 5'-конце, так как F1c участок гибридизируется с F1 регионом. На 3'-конце праймеры также гибридизируются с мишенью, и в итоге получается новая цепь с петлеобразными структурами на обоих концах. С такой, похожей на гантель ДНК начинается второй этап — цикл экспоненциальной амплификации. Цепи с несколькими инвертированными повторяющимися последовательностями ДНК мишени могут быть синтезированы благодаря повторениям процессов достраивания и смещения цепей [17].

В техническом исполнении реакция простая. Изотермическая амплификация выполняется в один этап, легко визуализируются конечные продукты. Быстро получается ответ по результатам исследования - через 15 - 60 минут. Обладает высокой специфичностью и чувствительностью метода. Использование 4 или 6 праймеров обеспечивают высокую специфичность реакции, так как они узнают 6 или 8 последовательностей-мишеней. Многие исследователи сообщают о высокой чувствительности LAMP до 6 копий искомого гена, что в 10 раз превышает чувствительность стандартной ПЦР. Экономически более выгодна чем ПЦР и ее виды, т. к. не требуется специальных дорогостоящих реагентов и оборудования. При этом количество амплифицированных продуктов в течение 15 - 60 мин приводит к образованию примерно 100 - 1000 копий ДНК мишени, а амплификация РНК проходит при добавлении обратной транскриптазы.

Преимущества LAMP-метода перед ПЦР (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительная характеристика ПЦР и LAMP

В настоящее время с помощью LAMP метода можно диагностировать возбудители таких вирусных заболеваний, как лихорадка денге, японский энцефалит, чикунгунья (тропическая комариная лихорадка), лихорадка Западного Нила, тяжелый острый респираторный синдром — ТОРС, высокопатогенный «птичий грипп» (H5N1). Метод LAMP используют также для определения бактериальных инфекций: род Salmonella, род Legionella, род Listeria, род Campylobacter, Esherichiae coli, продуцирующий веротоксин. С помощью метода LAMP диагностируются не только бактериальные и вирусные патогены, но также и инфекции, вызываемые простейшими. Одним из таких патогенов является малярийный плазмодий [18].