 |
3. Молекулярно-генетические методы в лабораторной диагностике различных инфекций
|
|
|
|
3. Молекулярно-генетические методы в лабораторной диагностике различных инфекций
Молекулярно-генетические методы диагностики - это большая группа методов, позволяющих обнаружить микроорганизм в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию ДНК (РНК) без его выделения в чистую культуру. В настоящее время молекулярно-генетические методы имеют огромное научное и прикладное значение: с их помощью реализованы масштабные исследования в области медицины и биологии, совершен прорыв в диагностике широкого спектра инфекционных заболеваний. Они стали неотъемлемой частью рутинной лабораторной практики, продолжая при этом совершенствоваться и развиваться. В настоящее время в практической диагностике и для научных исследований используется более десяти методов.
3. 1. Рестрикционный анализ
Сущность метода заключается в обработке ДНК рестрикционными ферментами (специфическими эндонуклеазами), разрезающими молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. После этого анализируют полученные фрагменты, специфические для каждого вида или варианта микроорганизма. Рестриктазы расщепляют молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Особое значение для методов молекулярной генетики имеют рестриктазы, которые определяют последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии. Точка разрыва ДНК может или совпадать с осью симметрии, или быть сдвинута относительно нее (рис. 8).
В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может происходить разрыв двойной спирали ДНК.
|
|
|
В геноме конкретной таксономической единицы находится строго определенное (генетически детерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы. Если выделенную из конкретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго определенного количества фрагментов ДНК фиксированного размера.
Размер каждого типа фрагментов можно идентифицировать с помощью электрофореза в агарозном геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем более крупные фрагменты, и длина их пробега больше. Гель окрашивают бромистым этидием и фотографируют в УФ-свете и получают рестрикционную карту определенного вида микробов. Сопоставляя карты рестрикции ДНК, выделенных из различных штаммов, можно определить их генетическое родство, выявить принадлежность к определенному виду или роду, а также обнаружить участки, подвергнутые мутациям. Этот метод используется также как начальный этап метода определения последовательности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гибридизации.
Рис 8. Схема рестрикционного анализа
[https: //nashaucheba. ru/docs/9/8435/conv_1/file1_html_6d49819c.png]
3. 2. Метод молекулярной гибридизации
Молекулярная гибридизация - молекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.
Методы молекулярной гибридизации позволяют выявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов.
|
|
|
Варианты проведения молекулярной гибридизации:
1. В растворе или на фильтре: капроновом или нитроцеллюлозном (рис. 9).
Рис. 9. Схема гибридизации на фильтре.
[https: //studfile. net/html/2706/44/html_FOdWildRtG. 7w9n/img-r7rGsn.jpg]
Условные обозначения: А - иммобилизованная на фильтре одноцепочечная ДНК; Б - одноцепочечная ДНК в растворе; В - фильтр с иммобилизованной одноцепочечной ДНК опускается в раствор, содержащий денатурированную молекулу ДНК
2. В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.
3. На микрочипах (эррей-гибридизация). Это наиболее совершенный метод, который позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК- зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены, присутствующие в ДНК микроорганизма.
4. На мембранах. Изучаемую ДНК фиксируют на мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов регистрируют флюоресценцию [4, 5].
Реакция гибридизации на мембранахподразделяется на этапы:
Ø Выделение ДНК (методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР).
Ø Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК (не более 5000 – 10 000 п. о. ). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.
Ø Нанесение денатурируемых ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране в виде точек (дот-блоты) или полосок (слот-блоты). Если небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле, а затем ДНК переносят из геля на поверхность мембран, то это называется саузерн-блотом. Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 80 º С или УФ-светом (рис. 10).
Рис. 10. Схема блоттинга по Саузерну
|
|
|
[https: //studfile. net/html/2706/44/html_FOdWildRtG. 7w9n/img-BhdcF9.jpg]
Ø Этап гибридизации проводится в несколько подэтапов:
– обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны;
– приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд;
– программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 65 º С.
Ø Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета [5].
Рис. 11. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образцах ДНК возбудителя специфическим меченым зондом
[https: //cf. ppt-online. org/files/slide/z/ZvhfGls9WnoCOcU5QzgASHrJByKbLtdxwap1R2Fj3/slide-34.jpg]
|
|
|
