3.3.4. Виды ПЦР

В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространенными модификациями ПЦР являются:

ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) – суть этой модификации состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения условий, которые обеспечивают специфический отжиг праймеров. В момент постановки ПЦР полимеразная активность фермента блокируется антителами или небольшими молекулами типа Affibody (аффинные молекулы - небольшие прочные белки, сконструированные для связывания с большим количеством целевых белков или пептидов с высокой аффинностью), имитирующих моноклональные антитела до наступления первой денатурации (при 95 °C в течение 10 минут). ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) – предназначен для амплификации, выделения или идентификации последовательности РНК. Вначале проводят синтез одноцепочечной молекулы ДНК (кДНК), с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), используя для матрицы мРНК. Затем образовавшуюся кДНК используют для последующей ПЦР.

Возможность использовать РНК в качестве мишени для ПЦР расширяет спектр применения метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирусы гриппа, ВИЧ и т. д. ) представлены именно РНК.

ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (End-point PCR) – эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Следовательно, решается проблема контаминации ампликонами. Одним из вариантов является метод «FLASH» (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization – специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами).

ПЦР в режиме «реального времени» (Real-Time PCR, ПЦР-РВ) – используется одновременно для амплификации и измерения количества искомой молекулы ДНК. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени с компьютерным учетом. Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют (обратимое включение молекулы или группы между другими молекулами или группами) в двухцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеозиды, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК (рис. 18).

Quantitation data for Cycling A. FAM/Sybr H5

 

Рис. 18. Результат компьютерного учета ПЦР в Real-Time вируса гриппа Н5N1

(фото авторов)

 

Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР – амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно. Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т. д., поместив пробы в одну пробирку.

Асимметричная ПЦР проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Сама ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

Метод молекулярных колоний ПЦР (ПЦР в геле, англ. Colony - PCR Colony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

ДНК-микроэррэй, микрочип (DNA microarray, microchip): плоская небольшая поверхность с нанесенными на нее в определенные позиции микроточками, содержащими олигонуклеотиды или кДНК, каждый из которых представляет определенный ген или не генный участок генома. Используется для гибридизации со смесями фрагментов ДНК или РНК. Те компоненты смесей, которые комплементарны нанесенным на микроэррэй точкам, образуют с ними комплементарные комплексы. Если компоненты смеси мечены флуоресцентным красителем, то соответствующие точки окрашиваются флуоресцентно и могут быть идентифицированы с помощью флуоресцентного микроскопа. Используются для сравнительного анализа геномов, и для выявления РНК, содержащихся в различных клетках. Представляют собой мощное средство сравнительного анализа, в котором одновременно анализируются тысячи образцов. Фиксированные на поверхности соединения называют пробами.

ПЦР длинных фрагментов (англ. long-range, PCR) – вариант ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Для реализации данного подхода используют смесь двух полимераз: Taq-полимеразы, которая характеризуется высокой процессивностью и способна за один проход синтезировать длинную цепь ДНК; Pfu-полимеразы, которая обладает 3'®5'- экзонуклеазной активностью и необходима для удаления некомплементарных нуклеотидов.

Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) – ПЦР с использованием консервативных праймеров к последовательностям ДНК для родственных групп внутри одного или между разными видами. В основе метода – подбор универсальных праймеров, например, к рибосомальным генам 18S и 26S для амплификации видоспецифического межгенного спейсера (подвижная часть молекулы, осуществляющая связь между двумя другими частями молекулы) [13, 14].

3. 3. 5. Преимущества и недостатки ПЦР (как метода диагностики инфекционных заболеваний):

Ø Прямое определение наличия возбудителей. Многие традиционные методы диагностики, например, иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

Ø Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность определяется нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа или других методов, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99 – 100 %.

Ø Высокая чувствительность. Метод ПЦР обладает высочайшей чувствительностью, которая достигает 99 – 100 % и позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК (РНК) - последовательности в исследуемом материале. Это позволяет использовать ее даже в тех случаях, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого микробного титра (например, при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций).

Ø Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одного диагностического материала.

Ø Универсальность материала исследования. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота, кал, грудное молоко и т. д. ), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка, кусочки органов и тканей и т. д. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д. ).

Ø Быстрота получения результата анализа. Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Это особенно заметно при исследовании медленнорастущих микроорганизмов. Однако даже в случае быстрорастущих культур оперативность ПЦР может быть полезной. Например, выделение, идентификация и определение лекарственной устойчивости у штаммов метициллин резистентного золотистого стафилококка (MRSA) с помощью традиционных микробиологических методов требуют не менее 3 - 5 дней, в то время как ПЦР-анализ позволяет выявить MRSA менее чем за сутки.

Ø Возможность диагностики не только острых, но и хронических, вялотекущих, скрытых, персистирующих инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для выявления труднокультивируемых, некультивируемых [15] и персистирующих форм микроорганизмов, которые характерны для латентных и хронических инфекций, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и являющихся внутриклеточными паразитами.

Ø Особенно следует отметить, что метод ПЦР дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов, трудно-выявляемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно существовать в организме хозяина.

Ø ПЦР может использоваться как метод диагностике не только инфекционных заболеваний, но и других патологических процессов, где есть вероятность роли в его развитии какого-либо патогена. Наиболее эффективно и обоснованно использование метода в урогинекологической практике – для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции, вируса папилломы человека (ВПЧ); в пульмонологии – для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии – для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний – в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии – для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Ø Использование ПЦР в связи с высокой специфичностью, высокой чувствительностью и быстрым получением результата может применяться для оценки эффективности и качества проводимого лечения.

Ø  Использование ПЦР в связи с высокой специфичностью, высокой чувствительностью и быстрым получением результата является одним из ведущих методов экспресс и ускоренной диагностики и открывает возможность для быстрого начала проведения противоэпидемических мероприятий и предотвращения распространения различных возбудителей, в том числе представляющих угрозу здоровью человека и имеющих международное значение.

В то же время высокая чувствительность ПЦР требует новых подходов к клинической интерпретации результатов, получаемых в лаборатории. В частности, выявление в клинических образцах сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать наличия патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента. По этой же причине следует с осторожностью использовать ПЦР для анализа образцов с характерным полимикробным сообществом (кал и материал, полученный из верхних дыхательных путей, гениталий и др. ).

Высокая чувствительность реакции ферментативной амплификации ДНК является одновременно ахиллесовой пятой технологии ПЦР. Этот парадокс известен также как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению (контаминированию) посторонними молекулами ДНК, которые могут служить мишенью для используемого набора праймеров. Даже единичные молекулы загрязняющей ДНК (РНК) могут быть многократно копированы в процессе ПЦР, приводя к образованию целевого ДНК (РНК) -продукта, и, следовательно, к ложноположительному результату.

При интерпретации результатов, полученных в реакции амплификации, возможны два типа проблем: отсутствие амплифицированного фрагментов при наличии ДНК-мишени в исследуемой пробе (ложноотрицательный результат), и присутствие амплифицированного фрагмента в случае отсутствия ДНК-мишени в пробе (ложноположительный результат) [16].

       Ложноотрицательные результатыпроявляются в отсутствии специфического амплифицированного фрагмента в пробе с положительным контролем, которая обязательно проводиться при каждой постановке ПЦР (реакционная смесь, в которую в качестве исследуемого образца вносится синтетический отрезок ДНК, содержащий определяемую последовательность аминокислот генома возбудителя). Подобный результат возникает при следующих причинах:

  - уменьшение концентрации ДНК в положительном контрольном образце, которая возникает при хранении. Для проверки этой возможности необходимо повторить амплификацию с повышенным количеством контрольной ДНК;

       - потеря или снижение активности ДНК-полимеразы, которая возникает при хранении. Для проверки этой возможности необходимо при повторной амплификации заменить препарат фермента или увеличить его количество в реакционной смеси;

- уменьшение количества дезоксинуклеотидтрифосфатов. Данные компоненты реакции достаточно стабильны при хранении, но при частых циклах замораживания-размораживания, внесении микробного загрязнения в раствор и хранении раствора в не замороженном состоянии возможно быстрое развитие микрофлоры. Для предупреждения этого необходимо разлить раствор нуклеотидтрифосфатов небольшими объемами и хранить при температуре не выше – 20 ^оС, размораживая непосредственно перед использованием;

- несоответствие условий реакции амплификации оптимальным: изменение рН, ионной силы реакционного буфера, снижение или отсутствие концентрации ионов магния в реакционной смеси (в наборах, где соль магния добавляется в реакционную смесь дополнительно). В этом случае необходимо повторить амплификацию с другим образцом буферного раствора и раствором соли магния;

   - низкая концентрация или специфичность праймеров. Эта проблема решается производителем набора.

Ложноположительные результаты, заключаются в присутствии специфической зоны с ожидаемым размером в пробе с отрицательным контролем, где специфическая ДНК-мишень заведомо отсутствует (вместо раствора ДНК добавляется вода или буферный раствор). Данное явление – это результат контаминации – попадание ДНК-мишени в реакционную смесь. Это может быть:

- случайная контаминация, возникающая при попадании ДНК или ранее синтезированных ампликонов с одежды, кожи, рабочих поверхностей, оборудования в случаях нарушения правил работы в лаборатории, например, при использовании одних и тех же дозаторов для электрофореза и приготовления реакционной смеси, совмещении помещений для выделения ДНК и приготовлении реакционной смеси и т. п. При повторной постановке ПЦР ложноположительный результат не повторяется;

- систематическая контаминация, возникающая при загрязнении ранее синтезированными ампликонами компонентов реакционной смеси (вода, буферный раствор и др. ). При повторной постановке ПЦР ложноположительный результат будет каждый раз повторяться.

Отрицательный результат в опытной пробе, при правильных положительном и отрицательном контролях, возникает не только в случае отсутствия ДНК-матрицы в исследуемой пробе, но и в случае присутствия в исследуемой пробе ингибиторов ПЦР (соли тяжелых металлов, гем и другие производные порфиpинов, меланин, гепаpин и др. ). Для предотвращения таких случаев необходимо использование наборов для ПЦР, предусматривающих присутствие в исследуемой пробе внутреннего контроля – ДНК-матрицы, содержащей участки связывания праймеров, но отличающейся по длине от определяемой ДНК-мишени на несколько сот нуклеотидов. Если внутренний контроль в наборе для ПЦР не используется, то для предотвращения попадания ингибиторов в реакционную смесь необходима тщательная отмывка ДНК от примесей в процессе ее выделения.

   Для количественного анализа в настоящее время широко используется иммуноферментный принцип выявления продуктов амплификации в плашечном формате. Он заключается в получении продукта ПЦР, содержащего метку, детектируемую соответствующим методом. Мечение амп­ли­кона возможно, как в процессе проведения ПЦР в результате использования меченных праймеров или нуклеотидтрифосфатов, так и после окончания амплификации в результате химической модификацией ампликона веществом-меткой. Количество метки при этом оказывается пропорционально количеству ампликонов, а те в свою очередь отражают количество ДНК-мишени в пробе. Методически количественное определение проходит в виде цветной ферментативной реакции в плоскодонных 96-луноч­ных планшетах, в лунках которых находится синтезированный в процессе ПЦР продукт. Интенсивность окраски в лунках после соответствующих обработок определяется колориметрически и вычисляется как количество метки, находящейся в каждой пробе. Метод позволяет в ряде случаев определить количество копий ДНК в образце, что невозможно с помощью электрофореза.

Существуют разные источники ПЦР-загрязнения. Наиболее частым является контаминирование реакционной смеси ДНК-продуктами предыдущих реакций. В результате ПЦР в каждой реакционной пробирке может образовываться более миллиарда копий исходной последовательности ДНК, каждая из которых, в свою очередь, является потенциальной мишенью для последующей амплификации. В процессе анализа синтезированные фрагменты ДНК могут легко распространяться в лаборатории в виде аэрозоля (при открывании реакционных пробирок), через руки исследователей и лабораторные принадлежности, загрязняя реактивы и материалы, используемые в ПЦР, и приводя к ложноположительному результату анализа образцов, в которых исходно отсутствовала ДНК искомого возбудителя. В случае высокой концентрации микробной ДНК в исследуемом клиническом материале ПЦР-загрязнение может происходить при переносе даже небольшого количества ДНК из одного образца в другой, например, через поверхность перчаток при открывании пробирок с образцами или через приспособления, используемые для механической гомогенизации тканей.

При использовании ПЦР с универсальными праймерами источником загрязняющей ДНК могут служить коммерческие препараты ДНК-полимераз и других реактивов, применяемых в ПЦР. В связи с опасностью получения ложноположительных результатов в лабораториях, постоянно использующих ПЦР в диагностических целях, необходимы соблюдение строгих требований и специальные подходы, направленные на снижение риска ПЦР-загрязнения.

Одним из наиболее существенных требований, предъявляемых к диагностическим ПЦР-лабораториям, является соблюдение системы безопасности, включающей в себя разделение лаборатории на «пред-ПЦР-помещения», где осуществляются обработка образцов и приготовление реакционных смесей, и «после-ПЦР-помещения», где анализируются продукты реакции. Обязательными являются также раздельное хранение реактивов и материалов, используемых на разных этапах ПЦР, максимальное использование одноразовых пластиковых материалов на этапе, предшествующем амплификации, и регулярная обработка помещений ультрафиолетовым (УФ) излучением, повреждающим загрязняющие последовательности ДНК.

Дополнительные меры, обеспечивающие защиту ПЦР от загрязнения, могут включать использование ламинарных боксов для работы с образцами и приготовления ПЦР-смесей, специальные биохимические (урацилгликозилаза) и физико-химические (УФ излучение + изопсорален) методы инактивации ПЦР-продуктов. Особенно важно для оценки достоверности данных ПЦР-анализа и отсутствия ложноположительных результатов регулярное исследование отрицательных контролей (не содержащих ДНК-мишень) параллельно с клиническими образцами.

Помимо опасности получения ложноположительных результатов существует и проблема, связанная со снижением чувствительности ПЦР, следствием которого являются ложноотрицательные результаты. На практике вопрос о соотношении теоретической (то есть максимально возможной) и реальной чувствительности ПЦР не всегда решается однозначно. Чувствительность ПЦР может быть снижена вследствие многих причин, наиболее важной из которых является ингибирование реакции компонентами биологических образцов.

Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в образцах крови (гемоглобин), мокроты, мочи, биопсийном материале. Различные вещества, например, часто используемые антикоагулянты (особенно гепарин) или компоненты кровяных питательных сред, могут также подавлять реакцию амплификации ДНК. Ингибирование ПЦР обычно можно выявить путем искусственного добавления ДНК-мишени к исследуемому образцу и ее последующей амплификации. Отрицательный результат, полученный с заведомо положительным контролем, может свидетельствовать о наличии ингибиторов, для устранения которых необходимо использовать разведение образца или специальные методы подготовки проб.

Серьезную проблему представляет также выбор конкретных методов подготовки клинических образцов к исследованию с помощью ПЦР. В настоящее время не существует универсальных подходов к выделению ДНК разных видов микроорганизмов из различных источников. Быстрые методы подготовки проб, предусматривающие возможность автоматизации, иногда не позволяют достичь требуемого уровня чувствительности. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие очистить и сконцентрировать микробную ДНК для ПЦР-анализа, оказываются трудоемкими и могут увеличивать риск контаминирования образцов.

ПЦР-диагностика является относительно дорогостоящей. Для ее реализации необходимо комплексное оснащение лаборатории, включая не только термоциклер и устройство для ДНК-электрофореза, но и отдельные центрифуги, холодильники, дозаторы и другое оборудование. Затраты на ПЦР включают высокую стоимость реактивов и расходуемых материалов. Поэтому только в случае выявления и исследования труднокультивируемых возбудителей ПЦР может быть сопоставима по стоимости с традиционными микробиологическими методами [4].

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: