 |
2.3. Получение и подготовка к заражению
|
|
|
|
2. 3. Получение и подготовка к заражению
Для вирусологических исследований чаще используют эмбрионы 7…12-дневного возраста, которые обычно получают из птицеводческих хозяйств, а в последнее время во многих случаях для исключения латентных инфекций — СПФ-КЭ. Можно выращивать эмбрионы непосредственно в лаборатории в обыкновенном термостате. Для этого берут яйца среднего размера, незагрязненные (мыть нельзя), предпочтительно от белых кур, хранившиеся не более 5…10 дней при 5…12°C. В исключительных случаях (возможность бактериального загрязнения поверхности) можно провести дезинфекцию в 1% растворе хлорамина или погрузить яйца в 3% раствор формалина при комнатной температуре на 5 мин., после чего их не вытирая помещают влажными в термостат. Инкубируют при температуре 37…38°С и относительной влажности 65…70%. В термостате яйца размещают в лотках, на специальных деревянных или металлических подставках. Для создания требуемой влажности на дно термостата помещают кювету с водой. В процессе инкубации яйца переворачивают, а термостат часто проветривают. По данным З. Лярски (1977) одно яйцо расходует 1 л кислорода в день. Заложенные на инкубацию яйца через 3…5 дней овоскопируют с целью контроля за развитием эмбрионов. Яйца, неоплодотворенные или содержащие погибшие эмбрионы, удаляют. Второй раз их рассматривают непосредственно перед заражением. Живые эмбрионы подвижны. Сосуды хорионаллантоисной оболочки наполнены кровью и имеют четкие границы, с 12-го дня видна пульсация главной аллантоисной вены. У погибших эмбрионов самостоятельные движения отсутствуют, сосуды нечеткие, прерывистые, кровь в сосудах скапливается только в отдельных участках. При овоскопировании отмечают простым карандашом на скорлупе границу пуги, распространение крупных кровеносных сосудов, хорионаллантоисной оболочки, бессосудистые или слабоинъецированные сосудами ее участки, место предлежания эмбриона, т. е. тот участок на скорлупе, где ближе всего к ней лежит эмбрион. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. Заражение куриных эмбрионов (КЭ) производят в помещениях в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением. Между манипуляциями инструменты держат погруженными в спирт, после чего обжигают на пламени горелки.
|
|
|
При заражении яйцо помещают на подставку (можно использовать стеклянные пробки с углублением посредине, баночки из-под горчицы, майонеза и др. ), скорлупу в месте заражения протирают ватой, смоченной спиртом, обжигают, зачем обрабатывают йодированным спиртом и снова обжигают.
2. 4. Заражение
Существует ряд способов заражения эмбрионов. Выбор метода определяется видом вируса, его тропизмом и целью заражения (с целью диагностики или для получения большого количества вируса). Чаще всего материал наносят на хорионаллантоисную оболочку или вводят в аллантоисную или амниотическую полости, реже в желточный мешок. Заражение в тело куриного эмбриона, его мозг, кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки применяют очень редко.
Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Этот метод используют для культивирования и выделения дерматропных, нейротропных и пантропных вирусов (оспы, чумы собак, крупного рогатого скота, болезни Ауески и др. ). Наиболее пригодны для этих целей эмбрионы 10…12-дневного возраста.
Рис. 2. Заражение на хорионаллантоисную оболочку:
А — подготовка эмбриона к заражению, Б — вид после заражения;
1 — отверстие, выпиленное в скорлупе, 2 — воздушное пространство,
3 — резиновый баллончик, 4 — отверстие в скорлупе, закрытое покровным стеклом; 5 — искусственная воздушная полость, 6 — хорионаллантоисная оболочка (по О. Г. Анджапаридзе).
|
|
|
Известны три модификации заражения на хорионаллантоисную оболочку:
а) скорлупу обрезают ножницами над пугой, отделяют небольшой кусочек подскорлупной оболочки и на обнажившийся участок хорионаллантоисной оболочки наносят материал. Отверстие закрывают стеклянным колпачком, крышечкой от стеклянного бюкса и для создания герметичности заливают парафином. Можно закрыть отверстие стерильным покровным стеклом, предварительно налив на скорлупу вокруг отверстия полузастывший парафин. Стекло необходимо провести через пламя горелки. Данный метод вызывает травматизацию хорионаллантоисной оболочки и мелкие кровоизлияния, поэтому малопригоден в случае дальнейшего патоморфологического исследования оболочки.
б) метод с созданием искусственной пуги (рис. 2). Над воздушным пространством копьем прокалывают скорлупу, а на боковой поверхности яйца в месте, где меньше проходит кровеносных сосудов, выпиливают надфилем (напильником), специальной пилочкой (для вскрытия ампул) или диском бормашины треугольник со сторонами 5…6 мм. На подскорлупную оболочку наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, через нее иглой осторожно разрывают подскорлупную оболочку и резиновым баллончиком слегка отсасывают воздух из естественного мешка, что вызывает перемещение хорионаллантоиса и образование искусственной пуги. Отверстие закрывают покровным стеклом или заклеивают лейкопластырем. Инкубируют яйца искусственной пугой вверх.
в) на границе пути со стороны предлежания эмбриона выпиливают треугольник (длина сторон около 1 см), пинцетом удаляют скорлупу и подскорлупную оболочку и вводят материал. Дефект закрывают лейкопластырем или покровным стеклом как указано выше.
Вируссодержащий материал вносят в дозах 0, 1.. 0, 2 см3.
Заражение в аллантоисную полость. Для заражения используют эмбрионы 10…11-дневного возраста, так как в этом периоде яйцо содержит наибольшее количество аллантоисной жидкости. Метод применяют при культивировании и выделении вирусов гриппа, чумы плотоядных, гепатита утят и др.
|
|
|
Известны два варианта заражения:
а) иглу вводят вертикально через пугу на глубину, равную расстоянию от верхушки пуги до ее границы, отмеченной карандашом. Затем иглу подвигают на глубину 3…5 мм в аллантоисную полость, прокалывая при этом хорионаллантоисную оболочку. Отверстие в скорлупе заливают парафином (рис. 3).
б) при овоскопировании на боковой поверхности яйца в месте предлежания эмбриона отмечают бессосудистый участок хорионаллантоисной оболочки. После соответствующей его обработки иглу вводят непосредственно в аллантоисную полость на глубину 2…3 мм. Для того чтобы жидкость обратно не вытекала, предварительно делают прокол скорлупы над воздушным пространством. Отверстие в скорлупе заливают парафином.
Вируссодержащий материал вносят в дозах 0, 1…0, 2 см3.
Заражение в амниотическую полость. Для заражения используют эмбрионы 7…11-дневного возраста. Метод применяют при культивировании и выделении вирусов гриппа, ньюкаслской болезни и др. Для удобства в работе эмбрион за 2…3 дня до заражения инкубируют пугой вверх. Зародыш и амнион смещаются вверх и становятся более доступными.
Рис. 3. Заражение в аллантоисную полость:
1 — желточный мешок, 2 — амниотическая полость, 3 — аллантоисная полость, 4 — хорионаллантоисная и подскорлупная оболочки,
5 — отверстие в скорлупе, 6 — воздушное пространство,
7 — зародыш, 8 — белочный мешок
(по О. Г. Анджапаридзе).
Известны два варианта заражения:
а) открытый способ (рис. 4). После дезинфекции срезают скорлупу над воздушным пространством, снимают часть подскорлупной оболочки, браншами пинцета прорывают хорионаллантоис в месте, лишенном крупных кровеносных сосудов, и продвигают осторожно пинцет в направлении эмбриона. Разведенными браншами пинцета захватывают амнион вверх и вводят в амниотическую полость 0, 05…0, 1 см3 испытуемой жидкости. После этого отпускают бранши пинцета и амнион занимает прежнее место. Отверстие в скорлупе закрывают стеклянным колпачком, покровным стеклом или лейкопластырем. В первых двух случаях для герметичности края заливают парафином.
|
|
|
б) закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе под контролем глаз, на овоскопе. Яйцо укладывают в боковом положении, иглу с затупленным концом вводят через воздушное пространство по направлению к эмбриону, который под давлением иглы начинает смещаться. Затем легким толчком прокалывают амнион и вводят материал. Способ заражения вызывает меньше травматических поражений, чем первый, но менее точен.
Рис. 4. Заражение в амниотическую полость:
1 — зародыш, 2 — хорионаллантоисная и подскорлупная оболочки,
3 — оболочка амниона, 4 —полость амниона,
5 — стеклянная крышка, 6 — парафин
(по О. Г. Анджапаридзе).
Заражение в желточный мешок. Для заражения используют эмбрионы 5…10-дневного возраста. Метод применяют при культивировании и выделении крупных вирусов. Известны два варианта заражения:
а) через отверстие над воздушном камерой. Яйцо помещают в боковом положении местом предлежания эмбриона вниз и иглу вводят под некоторым углом снизу вверх в желточный мешок до эмбриона (рис. 5)
Рис. 5. Заражение в желточный мешок:
1 — желточный мешок, 2 — подскорлупная и хорионаллантоисная оболочки, 3 — воздушное пространство, 4 — отверстие в скорлупе
(по О. Г. Анджапаридзе).
б) через отверстие на половине длины яйца со стороны желточного мешка. Яйцо помещают в боковом положении местом предлежания эмбриона вниз и иглу вводят сверху вниз по направлению к эмбриону на глубину около 1 см. Материал вводят в желточный мешок в объеме 0, 2…0, 3 см3.
Заражение в тело куриного эмбриона, внутримозговое заражение. Используют эмбрионы 7…12-дневного возраста. Для заражения вскрывают пугу и подтягивают пинцетом эмбрион. Материал вводят в различные участки тела или непосредственно в головной мозг. Неспецифическая гибель эмбрионов при таких методах заражения может достигать 30% и больше.
Заражение в крупные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки. Как и предыдущий метод в практике используют редко. При овоскопировании отмечают крупные кровеносные сосуды, в которые по току крови после удаления участков скорлупы тонкой иглой вводят вируссодержащий материал.
После заражения куриные эмбрионы метят простым карандашом, указывая дату заражения, вирус, дозу; после чего ставят в термостат.
|
|
|
