 |
3.3.2.3.Прочие растворы, используемые при культивировании клеток
|
|
|
|
3. 3. 2. 3. Прочие растворы, используемые при культивировании клеток
Диспергирующие растворы. Для получения однослойной культуры клеток необходимо приготовить однородную клеточную суспензию. Клетки можно отделить диспергированием (расщеплением) кусочка ткани протеолитическими ферментами, определенными химическими веществами и др. Чаще для этих целей используют ферменты — трипсин, коллагеназу, папаин и гиалуронидазу, которые оказывают избирательное действие. Так, трипсин, папаин и гиалуронидаза действуют на основное межклеточное вещество, а коллагеназа и эластаза — на волокнистые структуры.
Наиболее широкое распространение в массовой практике получил трипсин, обладающий более выраженными диспергирующими свойствами и оказывающий наименьшее губительное действие на клетки. В солевых растворах, на которых готовится его раствор, должны отсутствовать ионы кальция. Недостатком трипсинизации является частое образование слизистого осадка. Раствор трипсина можно использовать также для снятия клеток в поверхности стекла.
Раствор трипсина в десятикратной концентрации (2, 5%) можно готовить впрок (приложение 3), стерилизуя пропусканием через фильтр Зейтца и хранят в замороженном состоянии до 6месяцев. Рабочий раствор (0, 25%) готовят из концентрата непосредственно перед применением. При длительном хранении диспергирующая активность трипсина снижается, что отрицательно сказывается на качестве получаемых клеток. Следует учесть, что свои диспергирующие свойства трипсин лучше проявляет при рН 7, 4…7, 5.
Для снятия клеток с поверхности стекла применяют 0, 02% раствор версена (двунатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, трилона В, ЭДТА), который стерилизуют автоклавированием или фильтрованием. Срок годности версена при хранении в холодильнике 1 год. Диспергирующее действие версена объясняют связыванием им двухвалентных катионов, в частности, магния и кальция, т. е тех ионов, которые способствуют прилипанию клеток к стеклу и обеспечивают целостность тканевой культуры. Под действием версена клетки отделяются от стекла, округляются и образуют взвесь.
|
|
|
Готовые растворы трипсина и версена можно приобрести в институтах, выпускающих питательные среды для культивирования клеток. Для индикации рН солевых растворов и питательных сред к ним добавляют в конечной концентрации 0, 002% феноловый красный (фенолрот).
Для предотвращения бактериальной загрязненности в солевые растворы и питательные среды вносят антибиотики. Обычно используют пенициллин (натриевую соль), стрептомицин (хлоркальциевый комплекс) и микостатин (нистатин) в растворах, которые готовят непосредственно перед применением. Срок хранения раствора антибиотиков в холодильнике не более суток. Пенициллин и стрептомицин добавляют из расчета 100…200 ЕД/см3, а микостатин — 20…25 ЕД/см3. В более высоких концентрациях антибиотики могут оказать токсичное действие на клетоки.
3. 3. 2. 4. Приготовление питательной среды для внесения в культуры клеток
Все компоненты, из которых составляют питательные среды, должны быть проверены на бактериальную загрязненность. Для этого из каждой пробы (по 0, 2…0, 5 см3) делают посевы в 2 пробирки с МПБ и средой Сабуро. Бульоны с посевами выдерживают в термостате в течение 8 суток, а со средой Сабуро — 15 суток. Затем в среду добавляют антибиотики и феноловый красный (его не добавляют, если основу питательной среды составляет солевой раствор, в который он был внесен при изготовлении), устанавливают бикарбонатом рН: 7, 2…7, 4 для сред, основой которых является раствор Хенкса, 7, 4…7, 6 для естественных питательных сред и сред, основу которых составляет раствор Эрла.
|
|
|
Для предотвращения улетучивания СО2 и защелачивания солевые растворы и питательные среды, содержащие бикарбонат натрия, хранят в емкостях, плотно закрытых резиновыми пробками.
3. 4. Виды клеточных культур и методика их получения
Существуют различные принципы классификации клеточных культур:
I. В зависимости от методики первичной эксплантации и вида ткани:
1. Переживающие тканевые культуры.
2. Растущие культуры тканей:
а) плазменные;
б) однослойные;
1) первичнотрипсинизированные,
2) субкультуры,
3) диплоидные,
4) перевиваемые
II. По методу выращивания клеток:
1. Однослойные.
2. Роллерные.
3. Суспензионные.
4. Выращиваемые на микроносителях.
3. 4. 1. Переживающие клеточные культуры
Этот метод является одним из наиболее простых способов для культивирования вирусов. В отличие от растущих тканевых культур, ткань только сохраняет присущую ей жизнедеятельность. Пролиферация у нее отсутствует. Метод применяют очень редко. Был разработан и предложен Мейтландами еще в 1928 г. Методика культивирования, предложенная ими, существенно не изменилась. Ткань измельчают на кусочки величиной до 1…2 мм, отмывают в солевом растворе и помещают в колбу или пробирки с питательной средой (например, жидкостью Тироде с куриной сывороткой). Культуры заражают в момент их приготовления. Инкубируют в термостате при 35…37º С. Через 3…5 дней производят пассаж вируса или смену питательной среды. При ее регулярной смене жизнеспособность ткани можно поддерживать в течение 1…2 недель. О размножении вируса можно судить по отсутствию изменений цвета среды в пробирках с зараженной тканевой культурой и по переходу розовой окраски в желтую в контрольных пробирках.
Метод можно использовать для изоляции вируса, если брать культуру тканей (кусочки органов и др. материал), непосредственно от животного больного или без клинического проявления болезни при жизни — биопсии или непосредственно после убоя (смерти). Предварительное размножение вируса в «собственной» ткани с последующим переносом его на другие объекты (эмбрионы, культуры клеток) позволяет выделить вирус из исследуемого материала, в котором его нельзя было определить, заражая непосредственно культуры тканей.
|
|
|
