 |
3.2. Номенклатура (терминология) клеточных культур
|
|
|
|
3. 2. Номенклатура (терминология) клеточных культур
Массовое применение культур тканей и клеток в лабораториях мира и использование этой методики для различных целей привели к терминологической путанице. 3 июня 1966 г. в г. Сан-Франциско на ежегодном совещании Ассоциации тканевых культур была предложена унифицированная терминология для тканевых культур животных.
Ниже приведены основные термины в сокращенном варианте.
Тканевая культура — это сборное понятие, обозначающее систему, в которой клетки, ткани или органы, изъятые из организма животного, сохраняют жизнеспособность или способность размножаться in vitro более чем 24 часа.
В зависимости от вида биологического объекта, от того, что нужно поддерживать или выращивать (клетки, ткани, или органы) различают:
а) культуру клеток — клетки, растущие in vitro без образования ткани;
б) культуру тканей или органов — поддержание или рост тканей или целого органа, или его кусочков in vitro, при сохранении их дифференциации, структуры и функции.
Эксплантат — изолированный кусочек ткани или органа, используемый для культивирования.
Монослой — клетки, растущие в один слой на определенной поверхности.
Суспензионная культура — тип культуры, при котором клетки размножаются во взвешенном состоянии в питательной среде.
Первичная культура — культура, полученная из клеток, тканей или органов, взятых непосредственно из организма. Культура считается первичной до тех пор, пока ее не субкультивируют.
Клеточная линия получается из первичной культуры после первого пассажа, состоит из разнотипных клеток, представленных в первичной культуре.
Стабильная (перевиваемая) клеточная линия — линия клеток, способная субкультивироваться in vitro до бесконечности. Стабильной она считается тогда, когда прошла не менее 70 пассажей с трехдневными интервалами.
|
|
|
Клеточный штамм получают из первичной культуры или из клеточной линии. Это популяция однородных клеток (по одному или нескольким признакам — маркерам). Эти маркеры должны сохраняться в процессе последующего культивирования.
Клон — популяция клеток, происходящая от одной клетки путем митозов. Клон не всегда однороден.
Клонированный штамм или линия означает их происхождение непосредственно от клона.
Диплоидная клеточная линия — линия клеток, 75% которой имеют кариотип исходных нормальных клеток. Диплоидное число хромосом необязательно равнозначно диплоидному кариотипу, поскольку возможны случаи, когда клетка может терять один хромосомальный тип и приобретать другой. В этом случае клетка изменяет кариотип, но сохраняет диплоидное число хромосом. При описании диплоидной клеточной линии указывают число исследованных клеток, процент диплоидных клеток и их кариотип.
Гетероплоидная клеточная линия — линия клеток, которая содержит менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом. Этот термин не указывает на злокачественность клеток и способность их расти неопределенно долго in vitro. При их характеристике указывают кариотип и процент клеток с измененным кариотипом.
Эффективность посева — процент клеток, дающих начало колониям. При этом необходимо указывать общее число клеток в инокуляте, тип культурального сосуда и условия (среду, открытая или закрытая система, газовая среда и т. д. ).
Фибробласты — клетки веретенообразной или нерегулярной формы, образующие волокна. В клеточных культурах невозможно отличить фибробласты от клеток многих других типов. В культурах органов и тканей, где связи между клетками сохранились, их можно идентифицировать.
|
|
|
Эпителиальные клетки — теснолежащие рядом друг с другом клетки, которые образуют слой с очень незначительным количеством межклеточного вещества.
Многие авторы отмечают несовершенство номенклатуры. В настоящее время термин «культура тканей» включает в себя в широком смысле все методы —от культивирования отдельных клеток до культивирования целых органов. В практике культурой клеток называют систему более или менее однородных клеток, полученных из тканей какого-либо органа и культивируемых in vitro, a культурой тканей — кусочки ткани и возникающие из них участки клеточного роста, находящихся в специальной питательной среде.
3. 3. Организация производства клеточных культур
Организация производства клеточных культур требует соответствующего оборудования и оснащения, широкого набора растворов и сред, знания всех методических приемов приготовления отдельных видов культур и комплекса контрольных мероприятий на всех этапах работы.
3. 3. 1. Оборудование
Для работы с клеточными культурами необходимо иметь следующие виды лабораторной посуды: матрасы различной емкости, пробирки бактериологические из прозрачного стекла, чашки Петри, колбы, пипетки Мора, мерные пипетки, флаконы для питательных сред, мерные цилиндры, центрифужные стаканы, пластиковые панели для культивирования 96-, 24-, 12-, 6- и 4-луночные, стерильные, одноразовые; стерильные одноразовые пластиковые матрасы на 25, 50, 100 см3 и более, пипетки автоматические и др.
Матрасы должны быть изготовлены из нейтрального стекла, а остальная посуда — из обычного. Существует различные способы ее обработки, в каждой лаборатории свой — наиболее удобный, экономичный и дающий наилучшие результаты.
Основными требованиями к стеклянной посуде является тщательная ее обработка. Посуду из обычного стекла необходимо подвергать мытью и специальной обработке для создания нейтрального рН. Чаще всего для этих целей применяют мытье с детским мылом, гексаметафосфатом, порошком «Прогресс», пастой «Веста», триалоном. Если на поверхности дистиллированной воды после споласкивания вымытой посуды обнаруживаются следы детергента, посуду моют снова. Ее сушат при 80- и стерилизуют сухим жаром в течение 3 часов при 170º С.
|
|
|
Одним из наиболее распространенным является также метод, основанный на использовании хромовой смеси (хромника). Для этого новую посуду ершиком очищают от загрязнений, ополаскивают водой и обрабатывают хромником, который вносят в сосуд, обводя его внутреннюю поверхность. Избыток сливают после 2…3 часового контакта хромовой смеси со стеклом, промывают (не менее 10 раз) водопроводной водой, а затем споласкивают дистиллированной (не менее 8…10) раз таким образом, чтобы вода равномерно стекала со стенок посуды.
Посуду, бывшую в употреблении замачивают на ночь в теплом 3% растворе перекиси водород с 0, 1…0, 2% содержанием моющего средства, затем ершат в данном растворе не менее 10 раз, после чего ополаскивают (не менее 10 раз) в теплой водопроводной, а затем в 3…4 сменах дистиллированной воды.
Вымытую посуду сушат в сухожарных шкафах (60-80º С) 1…2 часа, устанавливая вниз горлышками, м после — монтируюта.
Матрасы, колбы, флаконы для питательных сред, пробирки перед стерилизацией лучше закрывать алюминиевой фольгой, чем ватными пробками, так как последние при стерилизации обугливаются и внутренняя поверхность посуды покрывается токсичным для клеток налетом смолообразных веществ.
Специальной обработке подвергают резиновые изделия— пробки, груши, трубки. Их вначале моют в горячей воде с детергентом, затем кипятят 1 час в 3…5% растворе двууглекислой соды, промывают горячей и холодной водой и снова кипятят в двух сменах дистиллированной воды. Если они уже были в употреблении, подготовка несколько упрощается — их кипятят 10... 15 минут в1% растворе детергента, промывают водопроводной водой и снова кипятят в двух сменах дистиллированной воды и сушат. Резиновые пробки стерилизуют автоклавированнем в течение 40 мин. при 1, 5 атм.
Фильтры Зейтца, воронки, чашки Петри стерилизуют таким же образом.
Металлические инструменты — пинцеты большие (хирургические) и малые (глазные), ножницы с остроконечными и закругленными браншами длиной в 10 и 17 см стерилизуют кипячением в течение 20…25 мин. в дистиллированной воде, после чего хранят в спирте.
В лаборатории необходимо иметь магнитные мешалки, центрифуги горизонтальные на 500…2000 об/мин, с объемами центрифужных стаканов до 250 см3 для осаждения и отмывания клеток и центрифуги горизонтальные на 5000…6000 об/мин, с объемами центрифужных стаканов на 500 см3 для осаждения эритроцитов при центрифугировании крови крупного рогатого скота, микроскопы, термостаты, рефрижераторы (+ 4º С) и низкотемпературные устройства (– 20º С) для хранения сыворотки, растворов трипсина, антибиотиков, сосуды Дьюара с жидким азотом для хранения музейных клеточных штаммов и линий, асбестовые и мембранные фильтры в установках Сальникова или Зейтца для фильтрования сред и растворов.
|
|
|
