 |
2.5. Отбор вируссодержащего материала
|
|
|
|
2. 5. Отбор вируссодержащего материала
Для получения аллантоисной жидкости пипеткой прорывают хорионаллантоисную оболочку (ХАО) в месте, лишенном крупных кровеносных сосудов, пинцетом слегка отодвигают ее внутрь и пипеткой с резиновой грушей (между раздвинутыми браншами пинцета) из аллантоисной полости отбирают жидкость. От одного эмбриона можно получить 6…10 см3 аллантоисной жидкости. Ее биологическая активность может снизиться в случае попадания эритроцитов из-за адсорбции вируса на них). Поэтому предварительно перед вскрытием все эмбрионы для уменьшения кровотечения помещают в холодильник на 19…20 час при 2…4º С или и на 1…2 часа при 15…20º С.
Для получения амниотической жидкости вначале отбирают аллантоисную, а затем пинцетом захватывают амниотическую оболочку и слегка приподнимают и производят отбор материала. От одного эмбриона можно получить 0, 5…1 см3 амниотической жидкости.
ХАО можно извлечь двумя способами. В первом случае из яйца последовательно удаляют эмбрион, а затем оболочку, которая оставалась на внутренней поверхности скорлупы. Во втором случае эмбрион извлекают из яйца вместе с ней, а затем отделяют в чашке Петри. При дальнейшем исследовании ХАО промывают в изотоническом растворе хлорида натрия, расстилают в чашке Петри и рассматривают на темном фоне характер фокусных поражений. Ее можно хранить в 50 % растворе глицерина или в замороженном состоянии без консерванта.
Амниотическую оболочку извлекают, вылив содержимое яйца в чашку Петри, через разрез в ХАО и, удалив эмбрион из амниотического мешка.
Для получения желточной оболочки разрезают ХАО, удаляют аллантоисную и амниотическую жидкости, слегка наклонив яйцо, извлекают пинцетом плод, отделяют его за пупочный канатик, захватывают желточный мешок и извлекают в чашку Петри. Его освобождают от содержимого. Дальнейшая обработка и хранение производится так же, как и ХАО.
|
|
|
2. 6. Индикация вируса в зараженных куриных эмбрионах
Длительность наблюдения за зараженными КЭ зависит от вида вируса и дозы его введения. Инфицированные яйца ежедневно овоскопируют. Погибшие в течение первых суток эмбрионы исключаются из опыта, так как причиной их гибели могли быть травма или токсическое действие инокулята. Реакция КЭ на вирусное заражение может быть различной. Наиболее ярким проявлением вирусного действия является гибель эмбриона или наличие каких-либо изменений (кровоизлияний, инъецирования сосудов, замедления нормального развития, скручивания эмбриона, уменьшения объема амниотической жидкости, увеличения объема аллантоисной жидкости, некротических очагов, образования телец включении и др. ). Однако эти изменения не всегда могут быть выражены, хотя вирус в эмбрионе находится в достаточном количестве. Его наличие в аллантоисной и амниотической жидкости определяют в реакции гемагглютинации капельным методом на стекле. При положительном результате проводят количественное определение вируса в развернутом ряду реакции гемагглютинации. Эту же реакцию используют для обнаружения вируса в хорионаллантоисной и амниотической оболочках, для чего проводят их предварительную обработку: готовят 10 % суспензию, центрифугируют и надосадочную жидкость используют в опыте.
Во всех случаях пробы отобранного материала проверяют на бактериальную стерильность.
Титрование вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью, осуществляют в РСК, РТГА, реакции нейтрализации, а вирусов, не обладающих гемагглютинирующей активностью, с помощью РСК.
Зачастую отрицательный результат не является свидетельством отсутствия вируса в исследуемом материале. Это может быть результатом его малого количества или резистентности эмбриона. Чтобы исключить первое предположение, проводят последовательные пассажи. Используют первоначальный метод заражения. Результат считают отрицательным, если вирус в материале не выявляют после проведения трех пассажей.
|
|
|
Вопросы для самоконтроля
1. Для каких целей используют куриные эмбрионы в вирусологии?
2. Достоинства и недостатки использования куриных эмбрионов в вирусологии.
3. Требования, предъявляемые к эмбрионам, используемым для заражения вируссодержащим материалом.
4. Подготовка куриных эмбрионов к заражению.
5. Перечислите основные методы используемые для заражения куриных эмбрионов и дайте их характеристику.
6. Способы получения вируссодержащего материала от куриных эмбрионов.
7. Индикация развития вирусов в куриных эмбрионах.
3. Культивирование вирусов в клеточных культурах
3. 1. Значение клеточных культур в вирусологических исследованиях
Быстрое развитие вирусологии во второй половине XX века в значительной степени обусловлено внедрением в практику клеточных культур, которые позволили решить одну из важных задач — выделение индивидуальных клеток, зараженных вирусом.
Первые попытки культивирования клеток животных вне организма были предприняты еще в 1885 г, когда А. С. Голубев П. П. Скворцов дал теоретическое обоснование этого метода. В дальнейшем возможность длительного поддержания тканей в жизнедеятельном состоянии практически доказал Гаррисон в 1907 г. Большая роль в разработке методов культивирования тканей принадлежит Каррелю, Мейтландам и др. Первые попытки культивирования вирусов в эксплантированных кусочках тканей предпринимали Ишигами (1902), Альдерсгоф и Броерс (1906), более успешно это осуществили Левадити (1913), Паркер и Най (1925) и др. В 40-х годах большую часть клеток выращивали в плазме или на фибриногеновом сгустке в присутствии тканевых экстрактов или их ультрафильтратов.
Однако метод культуры ткани не получил сразу широкого распространения в вирусологических исследованиях из-за трудоемкости, малого выхода вируса, постоянного бактериального загрязнения. Последнее обстоятельство служило главным препятствием в использовании этого метода. Радикальный поворот произошел после открытия антибиотиков.
|
|
|
Подлинная революция в вирусологии связана с работами Эндерса и сотрудников (1949). Ими была показана возможность культивирования вируса полиомиелита с цитопатическим действием в клеточных культурах и обосновано производство полиовакцины в первичных клетках почек обезьян.
Этот метод далвозможность выращивать любые типы клеток в виде первичных или перевиваемых культур. Аналогично методу выращивания бактерий в питательных средах клеточная культура стала своеобразной питательной средой для размножения вирусов. Метод получил широкое распространение во многих областях вирусологии. Его используют для:
- диагностических целей. Так, с помощью этого метода в
течение 50-х годов были выделены сотни до того неизвестных
вирусов, особенно вирусов, вызывающих латентную форму инфекции;
- производства специфических лечебно-профилактических и диагностических вирусных препаратов, причем препаратов высокоспецифичных, свободных от примеси балластных белков. Так как клетки вырастают в один слой, то при достаточной инфицирующей дозе удается достичь 100% заражения и получить максимальный выход вируса. Примеси клеточных белков бывают минимальными;
- количественного изучения вирусов и вируснейтрализующих антител и для проведения массовых вирусологических исследований;
- изучение основных биологических проблем (механизм репродукции вируса, изменение наследственных свойств и т. д. ).
В настоящее время трудно представить лабораторию, в которой могли бы выполнять современные вирусологические исследования без применения клеточных культур.
Благодаря использованию этого метода отпали ограничения, связанные с видовой чувствительностью животных к различным вирусам. Метод легко выполним и дешев.
Наряду с вышеперечисленными достоинствами ему присущи и недостатки, которые осложняют применение в вирусологической диагностике, и, особенно, в производстве вакцин. Главным из них является частое загрязнение (контаминация) исходного тканевого материала латентными вирусами, микоплазмами, дрожжами, плесневыми грибами и др. микроорганизмами. В настоящее время последнее частично преодолимо за счет использования СПФ-КЭ, хотя это несколько удорожает стоимость биопрепаратов.
Применяемые в практике клеточные культуры обладают различной чувствительностью к одному и тому же вирусу, поэтому подбор чувствительной клеточной системы, обеспечение ее высокой жизнеспособности и продуктивности в течение всего срока вирусологического исследования весьма важные условия успешного культивирования вирусов.
|
|
|
