 |
3.3.2. Солевые растворы и питательные среды
|
|
|
|
3. 3. 2. Солевые растворы и питательные среды
3. 3. 2. 1. Солевые растворы
Солевые растворы служат основой для приготовления питательных сред. Они должны содержать ионы в тех же количествах, что и в сыворотках крови. Солевые растворы обеспечивают осмотическое давление, сохраняют рН и снабжают клетки необходимыми неорганическими веществами.
Приготовление их требует соблюдения ряда условий: совместимость, порядок их растворения и чистота химических веществ, присутствие примесей, особенно солей тяжелых металлов, оказывает токсическое действие на клетки. Поэтому для приготовления растворов используют би- или тридистиллированную воду в день ее получения. Для перегонки применяют стеклянные дистилляторы. Воду не используют в день получения. Ее стерилизуют автоклавированием, закрывают резиновой пробкой и хранят на холоде не свыше 5 дней.
Так же как сыворотка крови, большинство питательных сред имеет сбалансированные фосфатно-бикарбонатные буферы. Однако такие среды быстро теряют СО2, поэтому клетки культивируют в герметически закрытых сосудах или в термостатах с атмосферой с повышенным содержанием СО2 (до 5%). Этого можно избежать, если использовать нелетучие буферы на основе фосфатов или, что более перспективно, замещенных сульфоновых кислот: N-2-оксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой (HEPES) и N-трис (оксиметил) метил-2-аминометансульфоновая (TES).
Предложены различные прописи сбалансированных солевых растворов, но наиболее часто используют растворы Хенкса и Эрла (приложение 1). Оба раствора имеют в своем составе бикарбонатный буфер, однако давление СО2 и буферность раствора Хенкса ниже, чем раствора Эрла. В то же время недостатком раствора Эрла является необходимость уравновешивания его пропусканием углекислого газа через жидкость перед использованием.
|
|
|
Солевые растворы стерилизуют фильтрованием при положительном давлении или автоклавируют. Нельзя стерилизовать в автоклаве растворы бикарбонатов и растворы, содержащие одновременно соли кальция, магния и фосфата. Так как они после этого становятся мутными, в них образуются нерастворимые осадки.
Для удобства в работе солевые растворы готовят в десятикратной концентрации (так называемые основные растворы, их можно хранить при комнатной температуре). Чтобы получить рабочий солевой раствор из основного, его разводят дистиллированной водой и добавляют необходимое количество бикарбоната натрия. Он необходим для создания определенного рН. В практике обычно готовят 1, 4, 5 или 7, 5% растворы, которые стерилизуют фильтрованием.
В настоящее время налажено централизованное снабжение лабораторий солевыми растворами.
3. 3. 2. 2. Питательные среды
К питательным средам предъявляют следующие требования:
- по солевому составу они должны быть близкими к таковым животного организма;
- иметь определенную концентрацию водородных ионов (рН);
- быть изотоничными и содержать необходимый для жизнедеятельности клеток набор питательных веществ: аминокислот, углеводов, витаминов и факторов роста.
В зависимости от целей использования различают ростовые и поддерживающие среды.
Ростовые среды (приложение 2)обеспечивают активное размножение клеток, а поддерживающие только их переживание, так как не содержат естественных стимулирующих продуктов илиимеют их в весьма незначительных количествах.
Состав среды должен обеспечивать нормальный рост и размножение клеток, а при культивировании вирусов — способствовать активному размножению их.
По характеру входящих в них компонентов питательные среды делятся на две группы: естественные и синтетические. Хотя приготовление последних значительно усовершенствовано и в настоящее время широко применяются, естественные среды не утеряли своего значения.
|
|
|
Естественные питательные среды. Достоинством этого вида сред является дешевизна и полноценность для культивирования клеток, а недостатком — сложность и нестандартность. В их состав входят сбалансированные солевые растворы и естественные жидкости организма (сыворотки животных, эмбриональный экстракт, амниотическая жидкость и др. ).
Сыворотка является важнейшей составной частью ростовых питательных сред. Попытки исследователей получить ее химический заменитель потерпели неудачу. Сыворотка необходима как для роста, так и для длительного прикрепления клеток к стеклу и выполняет целый ряд других функций. Различные клетки могут нуждаться в разных компонентах сыворотки — глобулинах, стероидных гормонах, инсулине, фетуине. Наиболее часто используют сыворотку коров, лошадей, реже — овец, кроликов и кур. Сыворотку проверяют на стерильность, при необходимости фильтруют. Применяют нативную или инактивированную (при 56º С в течение 30 мин. ) сыворотку. Ее хранят на холоде при температуре 2…4 или – 12…20º С в течение нескольких месяцев.
Некоторые индивидуальные сыворотки могут обладать токсичностью для клеток (вызывают склеивание, дегенерацию). Поэтому каждую ее серию следует проверять на токсичность путем внесения в культуры клеток параллельно с добавлением в контрольные культуры известной нетоксичной сыворотки. Токсичность сыворотки может быть ослаблена смешиванием нескольких образцов, взятых от разных животных.
Амниотическая жидкость. Она является составной частью некоторых ростовых и питательных поддерживающих сред. Чаще всего ее получают от коров 2…4-месячной беременности при убое на мясокомбинате. Поверхность матки обрабатывают настойкой йода, фломбируют пламенем и рассекают скальпелем. Жидкость отсасывают пипеткой, переносят в сосуд, проверяют на стерильность и при необходимости фильтруют. Срок хранения — 2…4 недели при 4º С. Рекомендуется собирать в одну емкость амниотическую жидкость от 2…3 коров.
|
|
|
Эмбриональный экстракт. Используют при культивировании однослойных клеточных культур в качестве стимулятора. Для этой цели чаще применяют экстракт коровьих эмбрионов, реже — куриных, так как может вызвать жировое перерождение клеток. Эмбрионы получают в асептических условиях. Мелкие эмбрионы длиной 10…14 см гомогенизируют целиком, а более крупные предварительно разрезают на куски, отмывают от крови солевым раствором, измельчают в ступке, добавляют равный объем солевого раствора, выдерживают в термостате при 37º С в течение 30 мин и центрифугируют при 3000 об/мин 30 мин. Отбирают надосадочную жидкость, которую замораживают при температуре – 15…20º С, оттаивают, снова центрифугируют, проверяют на стерильность, после чего используют для культивирования клеток.
Приготовление экстракта из куриного эмбриона проводится также. Для этой цели используют тело (без головы) 10…11-дневных эмбрионов. Можно приготовить куриный эмбриональный экстракт другим способом — пропусканием тканевой массы через 20…30-миллилитровый шприц с последующим ее сбором в пробирки. Дальнейшая обработка проводится так, как указано выше.
Срок хранения эмбрионального экстракта при температуре 2…4º С — неделя, при – 20º С — до 2 мес.
Другие среды биологического происхождения. Для культивирования клеточных культур используют также ферментативные гидролизаты белковых веществ: лактальбумина, казеина и белка крови крупного рогатого скота. Наиболее широкое применение для культивирования первичнотрипсинизированных и некоторых перевиваемых клеток получил гидролизат лактальбумина. В качестве ростовой среды используют 0, 5% гидролизат лактальбумина на солевом растворе Хенкса с содержанием 10…15% сыворотки. Поддерживающую среду готовят также, но без сыворотки, или с незначительной добавкой — до 2…5%. Сыворотку можно заменить амниотической жидкостью коров.
Синтетические питательные среды. Преимуществом синтетических сред является постоянный состав входящих в них ингредиентов, что позволяет стандартизировать условия эксперимента. В настоящее время известны различные их прописи, содержаще витамины, аминокислоты, минеральные соли, и др. вещества, обеспечивающие жизнеспособность клеток вне организма. К 1977 г. было опубликовано свыше 400 рецептов таких сред. Однако, для выращивания полноценных культур клеток к большинству из них необходимо добавить сыворотку — 5…10% в ростовую и 2…5% в поддерживающую. Все среды можно разделить на два вида: многоцелевого назначения и специального. Из первых наиболее широкое распространение получили среда 199 и среда Игла, а из специального назначения можно выделить среды для органных культур — Т8, для выращивания клеток амфибий, насекомых и др.
|
|
|
В настоящее время многие среды и растворы можно получить централизованно. К средам необходимо добавлять 10% сыворотки крупного рогатого скота.
Солевые растворы Хенкса, Эрла и питательные среды — среда 199, среда Игла и 0, 5%-ный раствор гидролизата лактальбумина выпускают Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов, институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН РФ.
Приобрести их можно также через систему «Зооветснаб».
Срок годности этих препаратов один год при хранении в холодильнике при температуре 2…4º С.
|
|
|
