3.5. Хранение и транспортировка клеток

В процессе работы с клеточными культурами возникает необходимость в их сохранении. Длительность сохранения жизнеспособности клеток вне организма зависит от их происхождения, состояния и концентрации, состава питательной среды и окружающей температуры. Извлеченные из организма кусочки тканей могжно хранить до трипсинизации в питательной среде при 4º С в течение 2…3 суток. При более длительном хранении выход жизнеспособных клеток на единицу массы резко снижается. Целесообразней кусочки тканей сразу же подвергать трипсинизации и хранить в питательной среде клетки в концентрации 10⁵…10⁸ в 1 см³. При этом среду через сутки необходимо удалить, поскольку она содержит клеточные токсины.

Растущие первичнотрипсинизированные и перевиваемые штаммовые клетки без пересевов при периодической смене питательной среды сохраняют жизнеспособность при 37º С в течение 3…4 недель, при комнатной температуре — на 1…2 недели больше.

В процессе работы с клеточными культурами возникает необходимость в более длительном их сохранении. Это имеет весьма важное практическое значение, так как при серийных пассажах клеточных линий возможны контаминация или неконтролируемое изменение клеток.

Наиболее полно этому удовлетворяет метод глубинного замораживания. Это позволяет исследователям:

- экспериментировать с клетками, свойства и характеристики которых, а также история происхождения и культивирования глубоко изучены и хорошо известны;

- создать условия для проведения сравнительных исследований со стандартными клетками на том же пассажном уровне при постановке экспериментов периодически, с интервалом в несколько лет;

- сохранить уникальные клетки, повторное получение которых невозможно или затруднено;

- экономить средства, которые были бы затрачены на серийное пассирование для поддержания клеточной культуры;

- устранить опасность потери клеточной культуры из-за контаминации, изменения свойств клеток и др.

Промышленность, выпускает специализированные установки для программного замораживания.

Возможно кратковременное сохранение замороженных клеток в низкотемпературном холодильнике (– 70º С), но оптимальные условия достигаются в жидком азоте (– 196º С) или в его парах (– 120º С). Метод широко применяют не только из-за низкой температуры, при которой прекращается метаболизм клеток, увеличивается (почти неограниченно долго) срок хранения, но и вследствие отсутствия механического повреждения клеток при этом.

Эффективность замораживания клеток во многом определяется режимом данного процесса. Сохранность клеток значительно повышается, если к ним добавляют защитные вещества. Последние должны быть нетоксичны для клеток, иметь малую молекулярную массу, хорошую растворимость и легко проникать через мембрану живых клеток. В большинстве методов используют защитное действие глицерина или диметилсульфоксида, которые быстро проникают в клетку и наиболее прочно связывают воду в внутри и вне ее. Можно применять также поливилпорролидон, полиэтилен, оксид и др. криопротекторы. Механизм из защитного действия основан на способности создания связей с водой, более прочных, чем связи молекул воды между собой. Это мешает формированию правильной кристаллической решетки льда и замедляет рост кристаллов в случае их образования. Кроме криопротекторов, в среду с клетками добавляют также 10…20% сыворотки.

Как правило, для наилучшего выживания используют медленное замораживание и быстрое оттаивание клеток. Замораживание не должно быть слишком медленным, так как увеличивает (облегчает) рост кристаллов льда. В то же время очень быстрое замораживание не обеспечивет выход воды из клеток.

Наиболее стабильные результаты получают и том случае, если температуру от 10 до – 20…30º С понижают со скоростью 1…3º С в минуту, затем следует охлаждение (10…30º С в минуту) до температуры – 90…120º С, после чего ампулы с клеточной взвесью переносят в жидкий_: азот, где и хранят при температуре    – 196º С.

Глицерин или диметилсульфоксид добавляют к питательной среде в концентрации 5…10%. При температуре – 196º С клетки хранят неограниченно долго. Жизнеспособность их после расконсервирования составляет около 40…97% (влияют условия и длительность хранения, природа клеток и др. ). Так, процент сохранения жизнеспособности перевиваемых клеток колеблется в пределах 85…97, диплоидных — 70…90, субкультур — 65-90, первичнотрипсинизированных — 40…45.

Оттаивание клеток проводят по возможности быстро, в течение 60…80 секунд в термостате или водяной бане при легком встряхивании ампул. Первые сутки клетки культивируют в той среде, в которой их замораживали, на следующий день для удаления глицерина питательную среду заменяют. Размороженные клетки сохраняют все свои первоначальные свойства.

Транспортируют клеточные культуры в виде монослоя в небольшом количестве питательной среды, содержащей 5% сыворотки, 80…90% клеток сохраняют свою жизнеспособность при транспортировке в течение 7…8 дней.

Перевозить клетки можно в виде суспензии (концентрация клеток 100 тыс. в 1 см³), а при необходимости понижения температуры до 4° число клеток должно быть удвоено. В последнем случае возможно разрушение клеток и освобождение имеющегося в них токсина. Поэтому клетки после доставки необходимо промыть свежей средой.