 |
3.6.2. Идентификация вирусов, выделенных в культурах клеток
|
|
|
|
3. 6. 2. Идентификация вирусов, выделенных в культурах клеток
Характер ЦПД, морфология и локализация внутриклеточных телец-включений, гемадсорбирующие свойства вируса могут быть использованы для ориентировочного суждения о природе выделенного агента. Точное определение его типовой принадлежности проводят с помощью серологических реакций, ПЦР.
Для типирования вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью, используют реакции торможения гемагглютинации, задержки гемадсорбции, нейтрализации с учетом результатов по гемадсорбции или РСК, для типирования остальных вирусов применяют реакцию нейтрализации цитопатических изменений, РСК, реакцию диффузионной преципитации в агаровом геле и др.
3. 7. Методы культивировании клеток и вирусов
При работе с клеточными культурами приходится решать вопрос повышения эффективности использования компонентов среды и увеличения продуктивности клеток. Особенно остро он стоит при производстве биопрепаратов (вирусных вакцин, антигенов и др. ).
В настоящее время методы культивирования вирусов можно разделить, на два вида:
- выращивание клеток, связанных с субстратом (стационарное культивирование);
- выращивание клеток в суспензии.
При стационарном культивировании различают: однослойные стационарные, роллерные культуры и культуры на микроносителях.
Однослойные стационарные культуры являются типичным приемом выращивания клеток и вирусов — на стенках пробирок, матрасов и др. сосудов. Субстратом для выращивания клеток является стекло и пластиковая посуда, обладающая целым рядом достоинств: лучшими оптическими свойствами, легко стерилизуется гаммаоблучением, низкой стоимостью при массовом получении сосудов разнообразных форм и размеров, что обусловливает возможность ее одноразового использования.
|
|
|
Роллерное культивирование клеток
Длительное время первично-трипсинизированные, диплоидные и перевиваемые клеточные культуры применяли только в виде однослойных стационарных культур. В ряде случаев они незаменимы в условиях лаборатории, особенно при выделении вирусов, их идентификации и др. Вместе с тем подобная методика и культивирования из-за существенных недостатков — большими затратами времени, материалов, малого выхода биомассы, малоприменима при промышленном производстве биопрепаратов — вакцин, диагностикумов и др.
Более пригодны для этих целей роллерные культуры, в которых клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой. По сравнению со однослойными стационарными они экономически более выгодны за счет увеличения полезной площади роста клеток при уменьшении объема питательной среды. За счет постоянной смены жидкой и воздушной сред, омывающих монослой, создаются благоприятные физиологические условия для роста клеток. Это способствует значительному повышению репродукции и накоплению вирусов в культуре. В отдельных случаях часть клеток не прикрепляется и находится во взвешенном состоянии. В подобных случаях говорят о роллерно-суспензионных культурах.
Для увеличения площади для прикрепления и размножения клеток используют различные приемы. На начальном этапе это были основы с большой удельной поверхностью — твердые, губчатые, из шерсти, коллагена, на стеклянных спиралях и т. д. Но в силу определенных трудностей в работе с клетками, они не получили широкого распространения. Эффективным является вращение сосудов в которых происходит размножение клеток — от пробирок до бутылок различной емкости — от 0, 3 до 20 л. Их помещают в роллеры — специальные стеллажно-ярусные аппараты или барабаны.
|
|
|
Важное значение при роллерном культивировании играют различные факторы:
- вид клеток (наиболее высокой способностью к росту и размножению обладают субкультуры, перевиваемые, в меньшей — первичные и диплоидные);
- скорость вращения флаконов в роллерах (слишком быстрое — препятствует прикреплению клеток, чрезмерно низкое — ухудшает условия их питания, наиболее универсальная скорость вращения — в пределах 0, 5-1 об/мин);
- состав питательной среды (определяется видом клеточной культуры) и ее объем от емкости роллерного флакона (оптимальное соотношение 1: 10…1: 20);
- степень адаптации клеток к новым условиям культивирования (применительно к перевиваемым культурам клеток — чем большее число пассажей в роллере, тем выше индекс пролиферации);
- посевная доза клеток (в пределах 60…200 тыс/см2, выше — для первичных, ниже — для перевиваемых)
Роллерный метод позволяет получать более высокий урожай клеток. Так с одного роллера емкостью 3 л получают в 8 раз больше клеток HeLa, в 9 — ВНК-21, чем с 1 л матраса, а кратность экономии питательной среды составляет 2, 8 и 3, 0, соответственно. При этом сокращается в соответствующее число раз количество манипуляций по подготовке посуды, затраты времени для пересева клеточных культур
|
|
|
