3.6. Заражение клеточных культур

3. 6. Заражение клеточных культур

Для заражения отбирают пробирки (матрасы), в которых среда прозрачная, красноватого цвета с легкой опалесценцией, со сплошным клеточным монослоем (определяют под микроскопом). Заражение культуры производят после замены ростовой питательной среды на поддерживающую, которая в большинстве случаев отличается только меньшим содержанием в ней сыворотки (рис. 9). После удаления ростовой питательной среды клетки отмывают 2 раза раствором Хенкса (часто эту манипуляцию в производственных лабораториях не проводят). Часть культур (не менее 4 пробирок) оставляют в качестве контроля: в них вносят по 0, 1 см³ поддерживающей среды. В остальные пробирки инокулируют по 0, 1 см³ вируссодержащий жидкости. Все клеточные культуры (контрольные и опытные) помещают в термостат и выдерживают при температуре 37º С 30…60 мин. После контакта в пробирки добавляют по 0, 9 см³ поддерживающей среды и помещают в термостат для инкубирования. Иногда для упрощения вирус вводят сразу в поддерживающую среду. Так поступают при работе с известным патогеном.

 

Рис. 9. Схема заражения клеточной культуры вирусом:

1 — поддерживающая питательная среда, 2 — вируссодержащий материал;  — удаление вируса,   — внесение вируса по 0, 1 см³,  — внесение питательной среды по 0, 1 см³,  — внесение питательной среды по 0, 9 см³после инкубации в термостате
(по Я. Е. Колякову и соавт. )

 

При выделении вируса из материала, присланного для исследования, используют технику адсорбционного заражения, основанную на внесении довольно большого количества — около 0, 5 см³ — исследуемой взвеси непосредственно на слой культуры. После 1…4-часового контакта при температуре 37º С взвесь отбирают пипеткой, клеточную культуру несколько раз промывают буферным раствором, а затем в пробирки вносят поддерживающую среду. При этом методе вирус максимально адсорбируется на поверхности клеток. Это особенно важно, если его концентрация в присланном материале не велика.

3. 6. 1. Индикация вируса в зараженных клеточных культурах

Наличие вируса в зараженной клеточной культуре можно определить различными методами:

- обнаружением специфической дегенерации клеток;

- обнаружением внутриклеточных телец-включений;

-  цветная проба;

- метод образования бляшек;

- обнаружением антигена методами флюоресцирующих антител или иммуноферментным;

- реакцией гемадсорбции и гемагглютинации.

Для выявления морфологических изменений зараженные клеточные культуры ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа. Многие вирусы при размножении в клетках вызывают их дегенерацию, т. е. оказывают цитопатогенное действие (ЦПД).

Различают три основных типа цитопатических изменений: образование многоядерных гигантских клеток и симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток; круглоклеточную дегенерацию, возникающую вследствие утраты межклеточных связей и округления клеток.

Время развития и характер ЦПД определяют свойства и доза инокулированного вируса; свойства и условия культивирования клеток. У большинства вирусов ЦПД наблюдают через 3…14 дней после заражения клеточных культур.

Типичные изменения в клетках развиваются при инфицировании средними дозами вируса (1000…10000 ЦПД₅₀). в то время как массивные дозы вируса вызывают быструю гибель клеток с полным отслоением клеток от стекла, а малые — медленно развивающуюся очаговую дегенерацию клеток.

Цитопатическое действие вирусов необходимо отличать:

а) от неспецифической «возрастной» дегенерации клеток, наблюдаемой в старых культурах;

б) дегенерации клеток, вызванной контаминирующими вирусами.

Первые два типа дегенерации могут быть подтверждены или исключены путем сравнения контрольных и зараженных клеточных культур. Изменения в клетках, наступившие в результате токсического действия инокулированного материала, чаще обнаруживают в течение первых суток после заражения. Однако, чтобы полностью исключить этот фактор, необходимо провести еще один пассаж, для этого берут культуральную жидкость из пробирок с дегенерированными клетками и вносят в пробирки со свежими культурами. Если дегенерация была вызвана токсическим фактором, то во втором пассаже у клеток она не разовьется. Степень выраженности ЦПД оценивают знаками: + + + + — деструкция всех клеток в пробирках, с образованием пустот в монослое вследствие сползания клеток со стенок пробирки; + + + — деструкция более половины клеток; + + — деструкция половины клеток; + — несколько очагов деструкции; ± — деструкция отдельных клеток; – — отсутствие дегенерации.

Если степень дегенерации клеток выражена на ++ и выше, то проводят серологическую идентификацию вируса; если ниже двух крестов и с удлинением времени она не увеличивается, то проводят последующие пассажи вируса. Для этого зараженные культуры подвергают 2…3-кратному замораживанию и оттаиванию для извлечения внутриклеточного вируса, затем культуральную жидкость освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин. Полученный материал используют для заражения свежих культур. В положительных случаях наблюдают более интенсивное и раннее проявление ЦПД вируса.

Тельца включения — особые образования, которые появляются в цитоплазме или ядре клеток при их заражении некоторыми вирусами. Их обнаружение после окраски свидетельствует о наличии вируса в исследуемом материале. Наиболее известны тельца-включения Бабеша-Негри, игравшие ранее ведущую роль в лабораторной диагностике бешенства.

Для приготовления препаратов культур клеток для их выявления клетки выращивают на покровных стеклах в пробирках, заражают вирусом и после определенного времени инкубации (выращивания) вируса извлекают, фиксируют и подвергают окраске (чаще всего гематоксилин-эозином). Ядра клеток окрашиваются в синий цвет, цитоплазма — в розовый, а тельца включения — в зависимости от вида вируса в синий или розовый.

Обнаружение вируса методом цветной пробы основано на том, что незараженные клетки, выделяя продукты метаболизма, сдвигают рН среды в кислую сторону, что улавливают по пожелтению индикатора, добавленного в среду — фенолрота. В то же время жидкость в культурах, зараженных вирусом, который вызывает гибель клеток, сохраняет красный цвет. Наиболее демонстративно это явление отмечают при заражении вирусами с высокой скоростью репродукции или при культивировании на медленно растущих клетках.

Метод образования бляшек основан на образовании вирусом в однослойных культурах, покрытых агаровой средой, содержащей витальный краситель — нейтральрот, негативных (неокрашенных) колоний или бляшек. Бляшки представляют собой обесцвеченные участки культуры клеток, погибших под действием вируса. Заливка культуры клеток агаром предотвращает перенос вируса на другие места, т. е. она способствует фиксации вируса на месте первоначальной локализации.

Метод технически сложен. Однако может быть использован не только для индикации вируса, но и для определения его титра.

Особенностью применения иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов для индикации вирусов в клеточных культурах является то, что культуры клеток выращивают на стеклянных пластинках, помещенных в пробирки, что упрощает процесс обработки препаратов из-за возможности извлечения пластинок для последующей их обработки (фиксации, окраски и т. д. ).

Реакции гемагглютинации и гемадсорбции позволяют обнаружить вирус в тех случаях, когда он не вызывает видимых морфологических изменений в клетках или на ранней стадии его культивирования еще до наступления ЦПД.

Многие методы из-за их трудоемкости и сложности осуществимы лишь в специализированных лабораториях. Более подробно материал о них изложен в разделе

⇐ Предыдущая9101112131415161718Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: