 |
Суспензионное культивирование клеток
|
|
|
|
Суспензионное культивирование клеток
Возможность клеток размножаться в жидкой среде в свободно суспензированном (взвешенном) состоянии впервые была показана 1953 г. Оуенс и соавт.
В настоящее время данный метод широко применяют для накопления больших количеств клеток, вируссодержащего материала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов. Значительным шагом к его внедрению было изыскание способа ферментативного диспергирования тканей (наиболее часто для этих целей применяют трипсин) и, особенно, получение перевиваемых культур клеток, которых неограниченно долго можно культивировать во взвешенном состоянии. Клетки при этом размножаются, находясь в форме суспензии, не прикрепляются к стенкам культурального сосуда, чему способствует постоянное перемешивание среды. Гетероплоидные (перевиваемые) и анеуплоидные клетки (с увеличенным — «гипер» или уменьшенным — «гипо», не кратным гаплоидному, числом хромосом) постоянные линии, адаптируются быстрее к росту в суспензии, чем псевдодиплоидные линии (клеточные линии, в которых не менее 75% клеток содержат диплоидный набор хромосом, соответствующее числу хромосом в клетках животного, послужившего источником линии: при этом в качественном отношении кариотип клеток отличается от исходного).
Суспензионные культуры готовят из однослойных, которые отслаивают от стекла версеном или трипсином. После центрифугирования (1000 об/мин) осадок клеток ресуспендируют в свежей питательной среде и помещают в культуральные сосуды (ферментеры, реакторы), из расчета оптимальной концентрации клеток в исходной суспензии при промышленном производстве 2…5× 105 (при научных исследованиях — от 0, 3 до 10× 105 в см3) и выращивают при постоянном перемешивании. В подобных случаях фаза логарифмического роста наступает не позднее 16-24 часов после приготовления культуры.
|
|
|
В условиях постоянства среды суспензионные клеточные культуры проходят характерные фазы: лаг-фазу, логарифмического роста, стационарную и логарифмического отмирания. Скорость размножения клеток в логарифмической фазе роста (фазе во многом определяющей выход клеток) выражают временем генерации — временем необходимым для удвоения популяции клеток в культуре.
На ранних этапах внедрения метода в практику размножение клеток в суспензии обеспечивалось непрерывным перемешиванием взвеси в условиях постоянства среды с помощью магнитной мешалки (скиннера), за счет быстрого вращения флаконов или т. н. системы «шейкер», когда эрленмейровские колбы с клетками помещали на шуттель-платформу.
Значительным вкладом в развитии данного метода явилось установление факта, что неограниченного деления (роста) клеток в суспензии можно добиться добавлением в нее в фазе логарифмического роста свежих порций среды. Это наблюдение легло в основу новых технологических приемов при суспензионном культивировании клеток.
Во-первых, были разработаны проточные системы, в которых скорость поступления питательной среды регулировали в зависимости от скорости размножения клеток в реакторе.
Во-вторых, появилась возможность математического моделирования процессов клеточного роста, контроля и автоматизации системы эксплуатации биореактора.
Практическое воплощение проточных систем реализовано в форме двух видов аппаратов, которые по различию в конструкции условно можно разделить на 2 группы:
1) хемостаты, в которых подачу среды в культуральный сосуд осуществляют с заданными интервалами времени по заранее разработанной программе;
|
|
|
2) турбидостаты, в которых скорость подачи среды регулируется фотометрически в зависимости от заданной плотности клеточной взвеси.
Более совершенной является система турбидостата, которая позволяет во многом автоматизировать систему эксплуатации ферментера и создает возможность поддержания клеточной взвеси в логарифмической фазе роста в течение длительного времени (месяцев и даже лет).
Культивирование на микроносителях
Приоритет в разработке метода культивирования клеток на микроносителях принадлежит Van Werel'y (1967).
Метод сочетает в себе элементы монослойного и суспензионного культивирования клеток, которые прикрепляются и растут в виде монослоя на поверхности мелких твердых частиц, т. н. микроносителях, представляющих собой полимерные шарики, находящиеся в форме суспензии. Ее создают с помощью какого-либо перемешивающего устройства, например, мешалки.
В некоторых литературных источниках метод описан под названием «метод псевдосуспензионного культивирования».
Требования к микроносителям:
- плотность 1, 05…1, 15 г/см3, что позволяет им находиться в суспензии во взвешенном состоянии;
- небольшой положительный заряд в пределах 1, 5…1, 8 МЭКВ/г, что обеспечивает лучшее прикрепление к ним клеток (отрицательный заряд);
- диаметр частиц 100…250 мкм, что обеспечивает площадь для роста сотен клеток;
- шаровидную, гладкую поверхность, прозрачность;
- отсутствие токсичности для клеток;
- незначительное впитывание компонентов питательной среды;
- универсальность, обеспечивающую возможность неоднократного использования и роста для различных видов клеток — первично-трипсинизированных, диплоидных и перевиваемых.
Наиболее полно соответствуют этим требованиям полимерные шарики — гранулированные формы препаратов различной химической природы. В производстве широко используют микроносители на основе поперечно-сшитого декстрана. В практике используют их коммерческие препараты зарубежного производства Цитодекс 1, 2, 3, Супербит, Биосилон и др. Наряду с этим могут применять микроносители, покрытые коллагеном или желатином (Oytodex 3); полистироловые (Biosilion, Cytospres); стеклянные с пониженной сорбцией компонентов питательной среды на их поверхности (Bioglass); DЕАЕ-целлюлозные (DE-53) для выращивания первичных и диплоидных культур, склонных к агрегированию.
|
|
|
Несмотря на довольно высокую стоимость микроносителей, метод культивирования клеток с их использованием приобретает все более широкое применение в биологической промышленности. Он имеет ряд преимуществ перед другими:
- высокий выход клеток, что достигается возможностью суспензирования в 1 см3 среды нескольких тысяч частиц микроносителя общей площадью до 50 см2/мл. Считают, что на одном микроносителе могут поместиться 350-630 (или в среднем 460) клеток. Плотность клеточной популяции при этом может достичь 5-6 млн клеток в 1 см3 среды;
- более совершенный технологический процесс производства — создание равномерных условий по всему объему сосуда, что дает возможность постоянного контроля за параметрами культивирования различных видов клеток — первичных, перевиваемых и диплоидных (рН, рO2, температурой и др. ).
- экономичность — меньшая потребность в питательных средах при одновременном культивировании в 1 см3 высокой плотности клеточной популяции);
- возможность постоянного контроля за динамикой роста клеток;
- уменьшение числа манипуляций, связанных с разгерметизацией культурального сосуда, что значительно уменьшает риск контаминации;
- возможность искусственно создавать различные концентрации микроносителей с выросшими на них клетками и хранение подобного комплекса при низких температурах;
- возможность пассирования клеток без применения трипсина, путем добавления новых порций микроносителя и др.
Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных ферментерах для суспензионного культивирования. Вместе с тем не все из них пригодны для этих целей. Предпочтение отдают сосудам с круглым дном, гладкой силиконизированной внутренней поверхностью, исключающей прилипание микроносителей к стенкам, без выступов и карманов и др. При культивировании клеток стенки биореакторов можно также обрабатывать декстранами, метилцеллюлозой, коллагенами, желатиной, альбуминами, альгинат-натрием, α -лизином, поли-α -аргинином, гепарином, поливинилпирролидоном и др.
Эффективность культивирования определяется также питательной средой (требуется подборка для клеток в зависимости от типа микроносителя), концентрацией микроносителя и посевной дозой клеток, скоростью перемешивания суспензии и др.
Несмотря на довольно высокую стоимость компонентов, особенно микроносителей, данный метод весьма перспективен для использования в биологической промышленности, так как по сравнению с другими обеспечивает более высокий выход качественного сырья для производства вакцин, диакностикумов и других биопрепаратов.
|
|
|
