3.4.4. Перевиваемые культуры клеток.

Необходимо различать линии и штаммы перевиваемых клеток. Первым термином обозначают перевиваемые клетки, обладающие способностью к бесконечному росту и, как правило, гетероплоидным кариотипом; вторым термином — полуперевиваемые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни. В этом разделе под названием «перевиваемые культуры клеток» будут изложены сведения о клеточных линиях.

Перевиваемые культуры клеток имеют ряд преимуществ перед первичными:

- нет необходимости в постоянном снабжении свежими тканями;

- возможность применения бессывороточных сред (синтетических), что полностью устраняет возможность внесения инфекционных агентов (вирусов, микоплазм) с материалами животного происхождения;

- в силу значительной генетической однородности применение популяций клеток перевиваемых линий (особенно клонированных) обеспечивает более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные культуры, представляющие смешанную популяцию клеток;

- высокая скорость размножения;

- экономичность, простота манипуляций, легкость получения и др.

Однако наряду с вышеперечисленными достоинствами культуры перевиваемых клеток имеют серьезные недостатки и поэтому их в основном используют для диагностики и экспериментального изучения различных вирусов. Причинами подобного ограничения являются:

- сходство с клетками злокачественного типа (морфология, автономный рост, характер размножения in vitro, гетероплодия и др. );

- линии перевиваемых клеток, полученные из нормальных тканей животных, при длительном культивировании подвергаются малигизации (злокачественному перерождению), что в определенной степени ограничивает их использование при производстве вакцин.

-

Таблица 1

Перевиваемые линии клеток, полученные из органов и тканей некоторых видов животных

Вместе с тем известна линия клеток — фибробласты почек сирийского хомяка ВНК 21, которая по морфологии и кариотипу мало чем отличима от нормальных тканей. Так, она сохранила диплоидный набор хромосом и, в определенной степени, способность к контактному торможению. Предполагают, что она лишь в минимальной степени трансформирована.

Перевиваемые клетки были получены как из нормальных тканей, так и из злокачественных. Представителями первой группы являются клетки ПМС, СПЭВ, ВНК-21 и др., второй — клетки HeLa, Нер-1, Нер-2 и др).

Перечень некоторых перевиваемых линий клеток приведен в таблице 1.

Наиболее часто перевиваемые клеточные линии получают из популяции первичных, клетки которых обладают повышенной активностью роста и размножения.

Рис. 8. Схема получения перевиваемой культуры ткани:

1. — удаление питательной среды, 2 — приливание раствора версена, 3. — выдерживание в термостате при 37º С 20-30 мин, 4. — центрифугирование и удаление раствора версена, 5. — ресуспендирование в питательной среде и подсчет количества клеток, 6. — доведение до посевной концентрации, 7. — посев клеток при помешивании взвеси и помещение в термостат при 37º С; а — питательная среда, б — взвесь клеток
(по Я. Е. Колякову и соавт. )

Отбор осуществляют при регулярной смене среды, омывающей монослой первичнотрипсинизированной клеточной культуры. Смену среды проводят регулярно, не реже 1 раза в неделю. В течение первых 3 недель заменяют по 20…30% объема ростовой среды, в течение следующих 3... 4 недель — 50…60%, позднее проводят полную смену среды. По мере смены сред клетки меняют свою морфологию. Новые клеточные элементы, как правило, начинают появляться после 7... 10 смен в матрасе. Атипичные клетки отделяют от остальных участков монослоя и переносят в отдельные пробирки и матрасы. Не всегда отобранные атипичные элементы дают начало жизнеспособной линии перевиваемых клеток. Необходимо при этом соблюдать одно важное условие — всю работу в течение многих месяцев по получению новых клеточных линий необходимо проводить с одними и теми же питательными средами, сыворотками животных и сериями антибиотиков.

В лабораториях перевиваемые линии клеток поддерживают периодическими пересевами, включающими: а) удаление питательной среды; б) отделение клеток от поверхности стекла при помощи версена или трипсина; в) слив взвеси клеток в центрифужные стаканы и центрифугирование при 800…1000 об/мин в течение 10 мин; г) ресуспендирование клеток в свежей питательной среде (до концентрации 50…200 тыс. клеток в 1 см³ среды); д) посев клеток в сосуды для культивирования (рис. 8).

Предложены и другие модификации, в частности, исключающие центрифугирование и др.

При бесцентрифужном методе во флаконы с монослоем клеток вносят диспергирующий раствор (смесь растворов версена и трипсина в соотношении 9: 1), инкубируют при 37º С, а затем после начала отслоения клеток от стекла матрасы осторожно переворачивают так, что бы монослой находился сверху. Через 3…5 мин диспергирующий раствор (90…95% залитого объема) с клетками сливают. Для более высокого выхода клеток в матрасы добавляют питательную среду без сыворотки.