 |
Солевые растворы, применяемые при культивировании клеток
|
|
|
|
Солевые растворы, применяемые при культивировании клеток
1. Буферный раствор для ополаскиваниия (первичной эксплантации)
тканей:
| NaCl........................................ 8, 0 | КН2РО4................................... 0, 2 |
| КСl.......................................... 0, 2 | Бидистиллированной воды.... 1, 0 л |
| Na2HPO4∙ 12H2O...................... 2, 62 |
Приготовленный раствор (рН 7, 25…7, 35) фильтруют через фильтровальную бумагу и автоклавируют 30…40 мин при 1, 5 атм.
2. Буферный раствор для приготовления концентрированного (2, 5%)
раствора трипсина
В 1 л бидистиллированной воды последовательно растворяют (в г):
| NaCl........................................ 8, 0 | KH2PO4................................... 0, 2 |
| КСl.......................................... 0, 2 | MgCl2∙ 6H2O............................ 0, 1 |
| Na2HPO4∙ 12H2O...................... 2, 89 | CaCl2∙ 6H2O............................. 0, 1 |
3. Буферный раствор для приготовления рабочих растворов
трипсина (из концентрированного 2, 5%-ного раствора)
В 1 л бидистиллированной воды последовательно растворяют:
| NaCl....................................... 8, 0 | KH2PO4.................................. 0, 2 |
| КСl......................................... 0, 2 | MgCl2∙ 6H2O........................... 0, 1 |
| Na2HPO4∙ 12H20..................... 2, 89 |
Приготовленный раствор (pН 7, 2…7, 3) автоклавируют 10 мин при 0, 7 атм.
4. Солевой раствор Хенкса
Готовят из основных концентрированных растворов А, В, С и раствора индикатора фенолового красного (1: 1000).
Раствор А (содержание в 1 л)
| NaCl................................................ 160, 0 | MgCl2∙ 6H2O............................ 2, 0 |
| КСl.......................................... 8, 0 | CaCl2....................................... 2, 8 |
| MgSO4∙ 7H2O........................... 2, 89 |
Все компоненты, кроме хлористого кальция, растворяют в 500…700 см3 бидистиллированной воды. Хлористый кальции растворяют в 50 см3 бидистиллированной воды и по каплям приливают к первому раствору. Общий объем раствора доводят до 1 л, фильтруют через фильтровальную бумагу и автоклавируют 10 мин при 0, 7 атм.
|
|
|
Раствор В (содержание в 1 л)
| Na2HPO4∙ 12H20....................... 2, 6 | Глюкоза.................................. 20, 0 |
| KH2PO4................................... 1, 2 |
Фильтрование, автоклавирование проводят аналогично раствору А.
Раствор С
Для приготовления раствора С 14 г NaHCO3 растворяют в 1 л бидистиллированной воды и фильтруют через стерилизующие фильтры.
Раствор Хенкса готовят из основных ингредиентов следующим образом: по 50 см3 растворов А и В и 20 см3 рабочего раствора фенолового красного (1: 1000) смешивают в мерной колбе и доводят бидистиллированной водой до 1 л. Чтобы избежать двойной стерилизации, растворы А и В можно соединять в нестерильном виде. Автоклавирование проводят при 1, 5 атм. в течение 30…40 мин.
Для получения рабочего раствора на каждый литр указанной смеси добавляют 25 см3 раствора С.
Приложение 2
Ростовые среды
1. Среда 199 с аминопептидом и сывороткой
Десятикрадтный концентрат среды 199 разводят в 10 раз бидистиллированной водой, добавляют 5…7% аминопептида, 10% бычьей сыворотки; рН ростовой среды доводят до 7. 2…7, 4 с помощью 5% раствора соды.
2. Гемогидролизат с 10% бычьей сыворотки
Стерильный 5%-ный гемогидролизат смешивают с 10% стерильной бычьей сыворотки- Перед применением в готовую среду добавляют 7, 5%-ный раствор соды (для доведения рН до 7, 2…7, 4) и антибиотики.
3. Среда, состоящая из солевого раствора Хенкса с 10% аминопептида и 10% бычьей сыворотки
К 690 см3 бидистиллированной воды добавляют (в см3):
| Раствор Хенкса А................... 42, 5 | 5% раствор соды.................... 5, 0 |
| Раствор Хенкса В................... 42, 5 | Бычью сыворотку.................. 100 |
| Аминопептид.......................... 100 | Феноловый красный (0, 1%)... 20 |
4. Раствор Хенкса с гидролизатом лактальбумина и сывороткой
Для получения концентрированного 5% раствора гидролизата лактальбумина 50 г сухого препарата растворяют в 1 л раствора Хенкса (без порции С). Раствор инкубируют в водяной бане 10 мин при температуре 50…70º С до полного растворения лактальбумина и автоклавируют 10 мин при 0, 7 атм.
|
|
|
Для приготовления рабочей среды к 800 см3 раствора Хенкса с феноловым красным добавляют 100 см3 5% гидролизата лактальбумина и 100 см3 бычьей сыворотки. Среду фильтруют и добавляют антибиотики.
Приложение 3
Диспергирующие и другие растворы
1. Раствор трипсина
а) Для получения концентрированного (2. 5%) раствора трипсина к буферному раствору (раствор № 2, приложение 1) добавляют 25 г сухого трипсина и после энергичного встряхивания оставляют на 15…18 час при 4º С. Фильтруют через стерилизующие асбестовые фильтры. Хранят в замороженном состоянии при – 20º С.
б) Рабочий раствор трипсина (0, 25%) готовят из концентрата с помощью буферного раствора (раствор № 3, приложение 1).
2. Раствор версена
0, 2…0, 4 г этилендиамина тетраацетата растворяют при комнатной температуре в 1 л буферного раствора (буфер № 1 —приложение 2) и автоклавируют 40 мин- при 1, 5 атм.
3. Раствор фенолового красного (индикатор)
В ступку вносят 1 г порошка фенолового красного, добавляют 28, 2 см3 0, 1 Н раствора NaOH, растирают, смесь переносят в мерную колбу, смывая тщательно со стенок остатки красителя, доводят объем раствора до 1 л, пропускают через бумажный фильтр и автоклавируют 30…40 мин при 1, 5 атм.
|
|
|
