3.2. Ишемический инсульт, патогенез заболевания

При ишемии с последующей реперфузией повреждение в определенной зоне головного мозга развивается в три этапа: ишемия, реперфузия и пост-реперфузионная фаза. На первом этапе происходят события, в результате которых увеличивается вызванное недостатком АТФ поступление в клетку ионов кальция. Во время реперфузии увеличивается количество АФК вследствие дополнительного поступающего в клетку кислорода из кровотока, который нужен для восстановления запасов кислорода и который в то же время является источником дополнительных АФК. Также происходит синтез провоспалительных медиаторов и выставление молекул адгезии, отёк и нейровоспаление. Во время третьей фазы происходит ремоделирование тканей и адаптация, причем эти процессы также запускаются АФК (Kalogeris et al., 2014).

Во время ишемического инсульта происходит нарушение кровоснабжения нервной ткани из-за закупорки сосудов головного мозга, происходит истощение кислорода и глюкозы, и, как следствие, дефицит АТФ (Dirnagl et al., 1999). В условиях недостатка АТФ нарушается работа АТФ-зависимого натрий-калиевого насоса (Sundaram et al., 2019), что приводит к деполяризации нейронов, в ответ на которую происходит активация потенциал-зависимых кальциевых каналов в пресинаптической мембране и увеличение концентрации внутриклеточного кальция (Scott, Kammermeier, 2017), который связывается с белком везикул синаптотагмином (MacDougall et al., 2018), что приводит к слиянию везикул с пресинаптической мембраной и высвобождению медиатора в синапсах (Schneggenburger, Neher, 2005). Таким образом, большое количество возбуждающего нейромедиатора ЦНС глутамата накапливается во внеклеточном пространстве.

Астроциты участвуют в обратном захвате глутамата, но при их повреждении во время инсульта глутамат остается во внеклеточном пространстве (Jayaraj et al., 2019). Вода поступает в астроциты пассивно, так как приток натрия и хлора больше, чем выход калия, и происходит отек, который может затруднять реперфузию (Dirnagl et al., 1999; Jayaraj et al., 2019).

При истощении энергии, то есть при увеличении соотношения АМФ/АТФ и АДФ/АТФ, в клетке активируется киназа АМРК (Jiang et al., 2018). Увеличение уровня глутамата приводит к увеличению использования трансмембранного белка-переносчика глюкозы GLUT3 и к повышенной экспрессии AMPK, тогда как ингибирование AMPK может способствовать снижению использования GLUT3 и глюкозы (Jiang et al., 2018, цит. по Amato, Man, 2011). Таким образом, AMPK действует как ядерный регулятор энергетического метаболизма в мозге.

На мембране нейронов есть ионотропные (NMDA, AMPA и каинатные) и метаботропные (mGlu_1-8) рецепторы глутамата. Состояние, при котором эти рецепторы гиперактивированы, называют эксайтотоксичностью. NMDA-рецептор состоит из четырёх субъединиц: две обязательные NR1-субъединицы и две дополнительные, которые могут варьировать - это NR2A-D и NR3A-B. В большинстве случаев NMDA-рецептор состоит из двух пар субъединиц NR1/NR2A или NR1/NR2B, или является тригетеромером NR1/NR2A/NR2B, причем NR2A-содержащие рецепторы в основном локализуются на постсинаптической мембране, в то время как NR2B-содержащие рецепторы чаще всего являются внесинаптическими. Интересно, что повышенная активность глутаматных NMDA-рецепторов, расположенных вне синапса, играет основную роль в эксайтотоксичности, в то время как активация NMDA-рецепторов, которые находятся внутри синапса, может способствовать выживанию клеток (Parsons, Raymond, 2014). Различия в последствиях их активации - результат разной кинетики каналов рецепторов, содержащих NR2A или NR2B. Примерно в два раза больше ионов кальция поступает через рецепторы, содержащие NR2B-субъединицу из-за более медленной их деактивации (Erreger et al., 2005).

Активация ионотропных каинатных рецепторов глутамата приводит к увеличению уровня эксайтотокичности: показано, что антагонисты субъединицы GluK₁ этого рецептора защищают нейроны в моделях ишемии (Matute, 2010), а также на нокаутных по GluK₄ мышах показали высокую выживаемость нейронов после инъекции каината и при гипоксии-ишемии (Lowry et al., 2013). Однако в литературе также встречаются данные, указывающие на отсутствие влияния антагонистов каинатных рецепторов на повреждение (Goldberg, Choi, 1993).

Также глутамат активирует ионотропные AMPA-рецепторы, вызывает дополнительную деполяризацию за счет поступающих в клетку ионов натрия через ионный канал AMPA-рецептора, что приводит к удалению иона магния из ионного канала NMDA-рецептора (Dirnagl et al., 1999).

Метаботропные рецепторы глутамата делятся на три группы. На постсинаптической мембране преимущественно находятся рецепторы первой группы, mGlu₁ и mGlu₅, причем рецептор mGlu₅, в отличие от mGlu₁ встречается в коре больших полушарий. Активация рецептора mGlu₅ приводит к фосфорилированию NR2B-субъединицы (Niu et al., 2020) и, как следствие, к усилению кальциевого тока через NMDA-рецептор (Swanson et al., 2005).

Избыточный внутриклеточный Ca²⁺ может проникать в ядро и активировать экспрессию разных генов в зависимости от пути проникновения. Приток Ca²⁺ через синаптические NMDA-рецепторы может запускать в ядре путь CaMKIV/CREB, который индуцирует экспрессию генов, участвующих в регуляции метаболизма, синаптической передачи и выживания клеток. Напротив, гиперактивация внесинаптических NMDA-рецепторов при ишемии вызывает патогенную перегрузку Ca²⁺ и экспрессию генов, вызывающих апоптоз и нейродегенерацию (Uzdensky, 2019).

Когда уровень цитоплазматического кальция достигает критических значений, митохондрии начинают накапливать кальций, что вызывает изменение проницаемости внутренней мембраны митохондрий, разобщение дыхательной цепи митохондрий и образование АФК (Kristiá n, Siesjö, 1996; Frantseva et al., 2001; Jordan et al., 2011). Также возникающий при ишемии ацидоз способствует открытию митохондриальных пор, что приводит к развитию реперфузионного повреждения. Формирование пор происходит при реперфузии, так как для этого нужен более высокий рН, чем во время ацидоза при ишемии (Bakthavachalam, Shanmugam, 2017). Вследствие открытия митохондриальной поры образовавшиеся АФК попадают в цитоплазму и запускают образование АФК в других митохондриях. Это явление называется АФК-индуцируемое высвобождение АФК (Zorov et al., 2006). Основные источники митохондриальных АФК - дыхательные комплексы I-III, располагающиеся во внутренней мембране (Zorov et al., 2006, цит. по Cadenas et al, 1997; Turrens et al., 1985; Messner, Imlay, 2002), дегидрогеназы в матриксе (Zorov et al., 2006, цит. по Starkov, 2004) и моноаминооксидаза во внешней мембране (Zorov et al., 2006, цит. по Schnaitman, 1967).

Также поступающий в нейроны вторичный мессенджер Са²⁺ запускает ряд других сигнальных каскадов, например, активирует Са²⁺-зависимую цитозольную фосфолипазу А2, под действием которой образуется арахидоновая кислота (Windelborn, Lipton, 2008). В метаболизме арахидоновой кислоты участвует циклоокисгеназа-2 (ЦОГ-2), которая способствует высвобождению свободных радикалов (Im et al., 2004), приводящих к перекисному окислению липидов, в результате которого образуются малоновый диальдегид, 4-гидроксиноненаль и акролеин, которые связываются с белками и нуклеиновыми кислотами, что приводит к потери их функций и повреждению клетки (Muralikrishna Adibhatla, Hatcher, 2006; Yang, Li, 2016).

Ещё одним источником АФК может являться фермент НАДФН-оксидаза (Jayaraj et al., 2019). В цитоплазме избыточный кальций активирует протеинкиназу С (РКС), которая фосфорилирует субъединицу p47phox НАДФН-оксидазы (NOX). Фосфорилирование субъединицы р47phox вызывает транслокацию субъединиц p47phox, p67phox и p40phox к мембране митохондрии, где они присоединяются к каталитической субъединице gp91phox. Также для активации NOX необходимо взаимодействие между Rac и gp91phox. Активация NOX и последующая генерация АФК способствуют постишемическому нейрональному повреждению (Chen et al., 2011) (рис. 1).

Рисунок 1. События при ишемическом инсульте, приводящие к клеточной гибели. НКА - натрий-калиевая АТФаза, ФЛА2 - фосфолипаза А2, ЦОГ-2 - циклооксигеназа-2, ПГ - простагландины, АФК - активные формы кислорода, ПОЛ - перекисное окисление липидов.

Также при остром ишемическом инсульте может нарушиться целостность ГЭБ. Существует понятие о нейро-сосудистой единице, состоящей из эндотелиальных клеток, астроцитов, перицитов, нейронов и внеклеточного матрикса вокруг сосудов (Iadecola, Nedergaard, 2007). При остром ишемическом инсульте активируются матриксные металлопротеиназы (ММР) и циклоокигеназы, а также образуются свободные радикалы, NO и АФК, которые вызывают повреждение нейронов на начальных этапах развития заболевания, но также играют важную роль при восстановлении (Yang, Rosenberg, 2011). Снижение уровня кислорода и АТФ приводит к активации фактора, индуцируемого гипосксией 1α (HIF-1α ), который активирует конвертазу фурин, что приводит к активации матриксной металлопротеиназы-2 (ММР-2) (Yang, Rosenberg, 2011). Этот белок участвует в первой, обратимой, стадии открытия ГЭБ, разрушая белки базальной пластинки и плотные контакты эндотелиальных клеток, что также приводит к вазогенному отёку (Yang, Rosenberg, 2011, Jayaraj et al., 2019). В то же время, при нейровоспалении и в результате сниженного уровня кислорода и АТФ цитокины, например, TNFα и интерлейкин-1β, активируют транскрипционные факторы NF-κ B и АР-1, в результате чего экспрессируются ММР-3 и ММР-9, которые приводят ко второй, необратимой, стадии открытия ГЭБ. ЦОГ-2 также участвует в повреждении ГЭБ (Yang, Rosenberg, 2011).

События, происходящие при инсульте, приводят к окислительному стрессу и эксайтотоксичности, в результате чего активируются микроглия и астроциты, которые производят цитокины и хемокины, способствующие экспрессии молекул клеточной адгезии на мембране эндотелиальных клетках, вызывая таким образом инфильтрацию лейкоцитов в зону поражения (Jayaraj et al., 2019). Лейкоциты прикрепляются к эндотелию, что блокирует поток эритроцитов через микроциркуляторное русло. На поверхности эндотелия активированные лейкоциты продуцируют протеазы, ММР и АФК, которые могут повредить кровеносные сосуды и ткани мозга. Кроме того, активированные фосфолипазами лейкоциты вырабатывают эйкозаноиды, лейкотриены, простагландины и фактор активации тромбоцитов, что приводит к сужению сосудов и агрегации тромбоцитов. Также инфильтрированные лейкоциты усиливают повреждение нейронов, активируя провоспалительные факторы в зоне ишемической полутени (Kim et al., 2016). В то же время, эти клетки и молекулы участвуют в восстановлении: активированная микроглия действует как макрофаги, уничтожая мертвые клетки и выделяя противовоспалительные и нейротрофические факторы, которые способствуют нейрогенезу и пластичности мозга; лейкоциты, имеющие N2 фенотип, способствуют снижению воспаления; ММР играют важную роль в регенерации нейронов, пролиферации клеток и ангиогенезе; ЦОГ-2 участвует в синаптической пластичности (Jayaraj et al., 2019).

Провоспалительные факторы, такие, как интерлейкин-1β, интерлейкин-6 и TNFα, активируют сигнальный путь NF-κ B, который регулирует экспрессию генов, принимающих участие в воспалительных реакциях. В нормальных условиях NF-κ B локализован в цитоплазме и связан с ингибитором (Iκ B). В ответ на воспаление комплекс киназы Iκ B фосфорилирует Iκ B, а затем он убиквитинилируется, что приводит к его протеасомной деградации. Это способствует ядерной транслокации NF-κ B и его связыванию с генами, кодирующими провоспалительные цитокины, хемокины и молекулы адгезии. Экспрессия молекул, участвующих в сигнальных путях, связанных с воспалением, регулируется не только факторами транскрипции, но и некодирующими РНК на посттранскрипционном уровне (Cheng et al., 2014).

Кальпаин активируется в ответ на увеличение уровня внутриклеточного кальция и вызывает нарушение цитоскелета, например, расщепление белка МАР-2 в области дендритов (Ziemka-Nał cz et al., 2003), а также снижает активность РКС, которая ингибирует прокаспазу-9 (Shakeri et al., 2017).

Таким образом, следует учитывать функции потенциальных терапевтических мишеней как при нормальных, так и при патологических условиях.