 |
3.8. Салицил-карнозин - потенциальный антиоксидант
|
|
|
|
3. 8. Салицил-карнозин - потенциальный антиоксидант
Новое вещество - салицил-карнозин (рис. 5) - является соединением, содержащим карнозин и салициловую кислоту (патент №2694061 “Средство, обладающее антиагрегантной, цитопротекторной и антиоксидантной активностью” от 9 июля 2019).
|
| Рисунок 5. Химическая формула салицил-карнозина. |
Салицил-карнозин (СК) обладает антиоксидантной активностью, сравнимой с антиоксидантной активностью карнозина при измерении СОД-подобной активности, Fe2+-индуцированной хемилюминесценции, BaSO4-индуцированного дыхательного взрыва и при оценке стабилизации структуры эритроцитов при окислительном повреждении, вызванном гипохлоритом натрия, но в отличие от карнозина, СК не расщепляется тканевыми и сывороточными карнозиназами. Показано, что антиагрегантная активность СК в крови здоровых людей сопоставима с антиагрегантной активностью аспирина или превышает ее, но в отличие от аспирина, СК защищает слизистую оболочку желудка от образования язв и способствует их эпителизации. Таким образом, СК сохраняет фармакологически значимые свойства аспирина и карнозина, проявляя в то же время противоязвенную активность и устойчивость к гидролизу карнозиназ. (Kulikova et al., 2020).
4. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
В данной работе была поставлена цель исследовать нейропротекторные свойства салицил-карнозина и веществ сравнения в моделях глюкозо-кислородной депривации и NMDA-индуцированной эксайтотоксичности на первичной культуре клеток коры больших полушарий головного мозга 18-дневных эмбрионов крыс.
Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
|
|
|
1) Сравнить влияние салицил-карнозина, салициловой кислоты, ацетилсалициловой кислоты, карнозина на жизнеспособность первичной культуры клеток коры больших полушарий мозга крыс в условиях глюкозо-кислородной депривации;
2) Исследовать влияние салицил-карнозина на Akt, ERK1/2, JNKи количество про- и антиапоптотических белков в первичной культуре клеток коры больших полушарий мозга крыс в условиях глюкозо-кислородной депривации;
3) Сравнить влияние салицил-карнозина, ацетилсалициловой кислоты, карнозина на жизнеспособность первичной культуры клеток коры больших полушарий мозга крыс в модели NMDA-индуцированной эксайтотоксичности.
5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа проводилась на первичной культуре коры больших полушарий головного мозга 18-дневных эмбрионов крыс линии Вистар. Культуру выращивали в 6-луночных («SPL», США) и 96-луночных («Nunc», США) планшетах в среде Neurobasal Medium (NBM) («Gibco», США) с 2% бессывороточной добавкой В-27 Serum-Free Supplement («Gibco», США), 100 Ед/мл пенициллин-стрептомицина, 1% GlutaMAX («Gibco», США). Каждые двое суток производили замену половины объема среды на свежую.
Через 10 дней после посадки культуру помещали в условия ГКД на 4 часа, контрольная группа оставалась в условиях нормоксии, и уровень глюкозы в среде не менялся. Экспериментальные группы инкубировали в искусственной цереброспинальной жидкости (ИЦСЖ, 125 мМ NaCl, 26 мМ NaHCO3, 4 мМ KCl, 1, 25 мМ NaH2PO4, 1, 2 мМ MgCl2, 2 мМ CaCl2, 25 мМ глюкоза) без антиоксидантов, либо с добавлением исследуемого вещества (салицил-карнозина, салициловой кислоты, ацетилсалициловой кислоты или карнозина) в концентрации 0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ. После ГКД клетки помещали в условия нормоксии и меняли среду на NBM, содержащую 0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ вещество (салицил-карнозин, салициловую кислоту, ацетилсалициловую кислоту или карнозин). Контрольную группу на время эксперимента помещали в NBM без антиоксидантов. Спустя 1 час после начала реоксигенации собирали пробы для определения активированных киназ методом вестерн-блоттинга. Спустя 6 часов после начала реоксигенации собирали пробы для определения количества про- и антиапоптотических белков методом вестерн-блоттинга. Спустя 24 часа после начала реоксигенации проводили МТТ-тест для оценки выживаемости клеток и измеряли активность лактатдегидрогеназы, наличие в среде которой говорит о гибели клеток.
|
|
|
Для моделирования NMDA-индуцированной эксайтотоксичности использовали методику из Wan Ko et al., 1998. Через 10 дней после посадки к культуре добавляли 100 мкМ агонист глутаматных NMDA-рецепторов N-метил-D-аспартат (NMDA), растворенный в ИЦСЖ без ионов магния, так как они способны закрывать ионный канал глутаматных NMDA-рецепторов, и инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО2 5%. После культуре меняли среду на содержащую исследуемое вещество (салицил-карнозин, ацетилсалициловую кислоту или карнозин) в концентрации 0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ. Через 24 часа проводили МТТ-тест и измеряли активность лактатдегидрогеназы в среде.
|
|
|
