 |
5.7. Статистическая обработка результатов
|
|
|
|
5. 7. Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «GraphPad Prism 7. 0». Для определения достоверности различий использовали параметрические (t-критерий Стьюдента, однофакторный дисперсионный анализ) и непараметрические критерии (критерий Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса). Для проверки нормальности распределений использовали тест Шапиро-Уилка. Отличия считались достоверными при значении р< 0. 05.
6. Результаты И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
6. 1. Влияние салицил-карнозина, салициловой кислоты, ацетилсалициловой кислоты, карнозина на жизнеспособность первичной культуры клеток коры больших полушарий мозга крыс в условиях глюкозо-кислородной депривации
Через 24 часа после ГКД проводили МТТ-тест для оценки жизнеспособности культуры клеток и измеряли активность ЛДГ в среде для оценки гибели нейронов.
Таблица 1. Жизнеспособность нейронов, инкубированных в течение 4 часов в условиях нормоксии в NBM без антиоксидантов (принята за 100%) или в ИЦСЖ согласно МТТ-тесту. NBM - neurobasal medium, нейробазальная среда, ИЦСЖ - искусственная цереброспинальная жидкость. В таблице представлено среднее ± стандартное отклонение, n=9.
| NBM без антиоксидантов | ИЦСЖ | |
| Жизнеспособность культуры, % | 100±11, 3 | 95, 94±3, 77 |
Так как при проверке нейропротекторного действия веществ их растворяли в ИЦСЖ и инкубировали культуры с ними в течение 4 часов, провели эксперимент, выявляющий влияние ИЦСЖ на жизнеспособность нейронов. Для этого культуру нейронов инкубировали в течение 4 часов в NBM без антиоксидантов или в ИЦСЖ в условиях нормоксии. В этом эксперименте жизнеспособность нейронов, инкубированных в ИЦСЖ, составила 95, 94±3, 77% и статистически значимо не отличались от выживаемости нейронов, инкубированных в NBM без антиоксидантов (100±11, 3 %) (табл. 1, рис. 8).
|
|
|
|
| Рисунок 8. Жизнеспособность нейронов согласно МТТ-тесту. Культуры инкубировали в течение 4 часов в условиях нормоксии в NBM без антиоксидантов (NBM-AO) или в ИЦСЖ. Для проверки нормальности распределений использовали тест Шапиро-Уилка. Для определения достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента. На графике представлено среднее ± стандартное отклонение, n=9. |
Таким образом, мы убедились, что ИЦСЖ не влияет на жизнеспособность нейронов.
Таблица 2. Жизнеспособность нейронов после ГКД согласно МТТ-тесту относительно жизнеспособности культуры, не подвергавшейся ГКД (принята за 100%). ИЦСЖ - искусственная цереброспинальная жидкость, ГКД - глюкозо-кислородная депривация, СК - салицил-карнозин. В таблице представлено среднее ± стандартное отклонение, n=11-18.
| ИЦСЖ | ГКД | ГКД + 0, 2 мМ СК | ГКД + 0, 5 мМ СК | ГКД + 1 мМ СК | |
| Жизнеспособность культуры при инкубации с салицил-карнозином во время ГКД и реоксигенации, % | 100±3, 31 | 62, 45±3, 74 | 72, 76±5, 62 | 71, 19±4, 04 | 70, 2±4, 05 |
| ГКД | ГКД + 0, 2 мМ СК | ГКД + 0, 5 мМ СК | ГКД + 1 мМ СК | ||
| Жизнеспособность культуры при инкубации с салицил-карнозином во время реоксигенации, % | 65, 06±4, 53 | 66, 87±3, 88 | 70, 23±3, 23 | 70±4, 4 |
Для определения действующей концентрации СК был поставлен эксперимент с инкубацией культуры нейронов с СК в разных концентрациях (0, 2 мМ, 0, 5 мМ и 1 мМ) во время ГКД и реоксигенации или только во время реоксигенации. В проведенном эксперименте ГКД приводила к снижению жизнеспособности культуры на 37, 55% и 34, 94% относительно культуры, инкубированной в ИЦСЖ в условиях нормоксии (табл. 2), при этом выживаемость культур, перенесших ГКД, статистически значимо (p< 0, 0001) снижалась относительно культуры, инкубированной в ИЦСЖ в условиях нормоксии, независимо от концентрации СК.
|
|
|
Инкубация культуры с 0, 2 мМ, 0, 5 мМ и 1 мМ СК во время ГКД и реоксигенации приводила к увеличению жизнеспособности культуры на 10, 31%, 8, 74% и 7, 75% соответственно относительно культуры, инкубированной в условиях ГКД без СК (р< 0, 0001) (рис. 9).
Инкубация культуры с 0, 5 мМ и 1 мМ СК во время реоксигенации приводила к увеличению жизнеспособности культуры на 5, 17% (р=0, 0047) и 4, 94% (р=0, 0029) соответственно относительно культуры без добавления СК (рис 9).
 
|
| Рисунок 9. Жизнеспособность нейронов после ГКД согласно МТТ-тесту. Культуры инкубировали в ИЦСЖ в условиях нормоксии («ИЦСЖ») или в ИЦСЖ без глюкозы в условиях гипоксии в течение 4 часов с салицил-карнозином во время ГКД и реоксигенации или только во время реоксигенации в указанных концентрациях («0 мМ», «0, 2 мМ», «0, 5 мМ», «1 мМ»). Для проверки нормальности распределений использовали тест Шапиро-Уилка. Для определения достоверности различий использовали однофакторный дисперсионный анализ. На графике представлено среднее ± стандартное отклонение, n=11-18. * - p< 0, 05, ** - p< 0, 01, *** - p< 0, 001, **** - p< 0, 0001. |
Таким образом, основываясь на полученных данных, было принято решение использовать 0, 5 мМ и 1 мМ концентрацию веществ для проведения дальнейших экспериментов.
Таблица 3. Жизнеспособность нейронов после ГКД согласно МТТ-тесту относительно жизнеспособности культуры, не подвергавшейся ГКД (принята за 100%). ИЦСЖ - искусственная цереброспинальная жидкость, ГКД - глюкозо-кислородная депривация, АСК - ацетилсалициловая кислота, Сал - салициловая кислота, СК - салицил-карнозин. Исследуемые вещества добавляли в концентрации 0, 5 мМ. В таблице представлено среднее ± стандартное отклонение, n=10-18.
| ИЦСЖ | ГКД | ГКД+АСК | ГКД+Сал | ГКД+СК | |
| Жизнеспособность культуры при инкубации с веществами во время ГКД и реоксигенации, % | 100±3, 8 | 53, 04±2, 88 | 68, 14±3, 43 | 73, 57±3, 73 | 71, 37±3, 1 |
| Жизнеспособность культуры при инкубации с веществами во время реоксигенации, % | 55, 5±2, 74 | 57, 18±3, 05 | 58, 09±11, 4 | 62, 2±4, 58 |
Для оценки нейропротекторного действия СК относительно салициловой кислоты и ацетилсалициловой кислоты провели эксперимент с ГКД и инкубацией культур клеток с веществами во время ГКД и реоксигенации или только во время реоксигенации. В проведенном эксперименте ГКД приводила к снижению жизнеспособности культуры на 44, 5% и 46, 96% относительно культуры, инкубированной в ИЦСЖ в условиях нормоксии (табл. 3), при этом жизнеспособность культур, перенесших ГКД, статистически значимо (p< 0, 0001) снижалась относительно культуры, инкубированной в ИЦСЖ в условиях нормоксии, независимо от добавления исследуемых веществ.
|
|
|
Инкубация культуры с 0, 5 мМ СК во время ГКД и реоксигенации приводила к увеличению жизнеспособности культуры относительно группы без добавления веществ на 18, 33% (р< 0, 0001), инкубация с 0, 5 мМ ацетилсалициловой кислотой - на 15, 1% (р< 0, 0001), с 0, 5 мМ салициловой кислотой - на 20, 53% (р< 0, 0001) относительно культуры, инкубированной в условиях ГКД и во время реоксигенации без веществ, в то время как при инкубации с веществами только при реоксигенации статистически значимых отличий относительно культуры, инкубированной без веществ, не было обнаружено (рис. 10). Однако стоит отметить, что жизнеспособность культуры, инкубированной с 0, 5 мМ СК при реоксигенации, увеличилась относительно культуры без веществ на 6, 7% на уровне значимости р=0, 0538.
|
| Рисунок 10. Жизнеспособность нейронов после ГКД согласно МТТ-тесту. ИЦСЖ - искусственная цереброспинальная жидкость, ГКД - глюкозо-кислородная депривация, АСК - ацетилсалициловая кислота, Сал - салициловая кислота, СК - салицил-карнозин. Исследуемые вещества добавляли в концентрации 0, 5 мМ. Для проверки нормальности распределений использовали тест Шапиро-Уилка. Для определения достоверности различий использовали однофакторный дисперсионный анализ. На графике представлено среднее ± стандартное отклонение, n=10-18. * - p< 0, 05, ** - p< 0, 01, *** - p< 0, 001, **** - p< 0, 0001. |
В литературе представлены данные, показывающие, что в условиях 4-часовой ГКД карнозин при инкубации с ним во время ГКД и реоксигенации статистически значимо (р< 0, 001) увеличивает жизнеспособность первичной культуры нейронов крыс в концентрации 1 мМ, в то время как инкубация с 0, 5 мМ карнозином во время ГКД и реоксигенации не влияет на жизнеспособность культуры (Лопачев и др., 2016).
|
|
|
Также в литературе представлены данные, показывающие, что ацетилсалициловая кислота в организме распадается до салициловой кислоты, и нейропротекторный эффект обусловлен действием именно салициловой кислоты (Nyú l et al., 2018). В нашем эксперименте мы также показали, что эти вещества имеют сходный нейропротекторный эффект (рис. 10). Таким образом, в дальнейших экспериментальных исследованиях целесообразно использовать только одно из этих веществ для сравнения его нейропротекторного действия с действием салицил-карнозина. Ацетилсалициловая кислота была выбрана, так как именно это вещество используется в клинической практике (Nyú l et al., 2018).
Таким образом, салицил-карнозин проявляет большую нейропротекторную активность в условиях ГКД, чем препараты сравнения.
Таблица 4. Активность фермента ЛДГ в среде при инкубации с салицил-карнозином во время ГКД и реоксигенации или только во время реоксигенации относительно активности ЛДГ в среде культуры, не подвергавшейся ГКД (принята за 100%). ИЦСЖ - искусственная цереброспинальная жидкость, ГКД - глюкозо-кислородная депривация, СК - салицил-карнозин. В таблице представлено среднее ± стандартное отклонение, n=6-11.
| ИЦСЖ | ГКД | ГКД+1 мМ СК | |
| Активность ЛДГ в среде культуры при инкубации с 1 мМ СК во время ГКД и реоксигенации, % | 100±29, 21 | 455, 3±82, 32 | 315, 7±65, 87 |
| Активность ЛДГ в среде культуры при инкубации с 1 мМ СК во время реоксигенации, % | 422±48, 01 | 262, 2±122, 7 |
Для подтверждения данных о положительном влиянии салицил-карнозина на жизнеспособность нейронов по результатам МТТ-теста в следующей серии экспериментов оценили его влияние на гибель нейронов по активности ЛДГ в среде после инкубации нейронов с 1 мМ СК во время ГКД и реоксигенации или только во время реоксигенации.
В проведенном эксперименте ГКД приводила к увеличению активности ЛДГ в среде на 355, 3% (p< 0, 0001) и 322% (p=0, 0002) относительно культуры, инкубированной в ИЦСЖ в условиях нормоксии (табл. 4). Инкубация с 1 мМ СК во время ГКД и реоксигенации или только во время реоксигенации приводила к увеличению активности ЛДГ в среде относительно культуры, инкубированной в ИЦСЖ в условиях нормоксии, на 215, 7% (p< 0, 0001) и 162, 2% (р=0, 0004) соответственно.
Инкубация с 1мМ СК в условиях ГКД приводила к уменьшению активности ЛДГ в среде как при инкубации с ним во время ГКД и реоксигенации на 139, 6% (р=0, 0037), так и при инкубации с ним только во время реоксигенации на 159, 2% (р=0, 026) относительно культуры, инкубированной в условиях ГКД и во время реоксигенации без веществ, что свидетельствует об уменьшении количества погибших нейронов в культуре в условиях ГКД под действием СК (рис. 11).
|
|
|
|
| Рисунок 11. Активность фермента ЛДГ в среде при инкубации с салицил-карнозином во время ГКД и реоксигенации или только во время реоксигенации. Культуры инкубировали в ИЦСЖ в условиях нормоксии («ИЦСЖ») или в ИЦСЖ без глюкозы в условиях гипоксии в течение 4 часов с добавлением салицил-карнозина во время ГКД и реоксигенации или только во время реоксигенации в концентрации 1 мМ или без него («0 мМ», «1 мМ»). Для проверки нормальности распределений использовали тест Шапиро-Уилка. Для определения достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента. На графиках представлено среднее ± стандартное отклонение, n=6-11. * - p< 0, 05, ** - p< 0, 01. |
Таким образом, можно сделать вывод о том, что салицил-карнозин проявил большую нейропротекторную активность, чем вещества сравнения, в условиях глюкозо-кислородной депривации.
На основании полученных данных было принято решение для проведения дальнейших экспериментальных исследований использовать вещества в концентрации 1 мМ.
|
|
|
