 |
5.1. Подготовка первичной культуры клеток
|
|
|
|
5. 1. Подготовка первичной культуры клеток
За 24 часа до посадки первичной культуры нейронов коры больших полушарий головного мозга 18-дневных эмбрионов крыс в лунки 96-луночных планшетов вносили по 100 мкл стерилизованного поли-L-орнитина («Sigma», США) в концентрации 0, 1 мг/мл и в лунки 6-луночных планшетов - по 2 мл. В день посадки планшеты промывали стерилизованной дистиллированной водой.
Для получения первичной культуры нейронов коры больших полушарий беременных самок крыс эвтанизировали с помощью СО2, затем в стерильных условиях извлекали 18-дневные эмбрионы. Из эмбрионов извлекали головной мозг и отделяли большие полушария. Полученный биологический материал промывали в растворе Хэнкса, не содержащем ионы Са2+ и Mg2+ («ПанЭко», Россия), очищали от сосудов и инкубировали в растворе трипсина-ЭДТА («ПанЭко», Россия») в течение 20 минут при 37°С. Затем трипсин инактивировали 10% эмбриональной телячьей сывороткой крови (FBS), («ПанЭко», Россия) на растворе Хэнкса. Препарат дважды промывали раствором Хэнкса и суспендировали в среде МЕМ («ПанЭко», Россия) с 10% FBS и 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина («ПанЭко, Россия»). Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 2 минут при 400 g, ресуспендировали в среде МЕМ с перечисленными выше добавками и распределяли по планшетам с плотностью 1, 2•105 клеток на см2.
Культуру содержали в СО2-инкубаторе («SHEL LAB», США) при 37°С, 80% влажности, 5% СО2 в течение суток, затем среду заменяли на NBM («Gibco», США) с 2% бессывороточной добавкой В-27 Serum-Free Supplement («Gibco», США), 100 Ед/мл пенициллин-стрептомицина, 1% GlutaMAX («Gibco», США).
5. 2. Моделирование ишемии с помощью глюкозо-кислородной депривации
Для моделирования ГКД планшеты с экспериментальными пробами помещали в гипоксическую камеру на 4 часа при газовом составе 5% СО2, 1% О2, 94% N2, при этом в NBM не содержались антиоксиданты.
|
|
|
Культуры клеток, содержащиеся в 6- или 96-лучноных планшетах, были разделены на контрольные и экспериментальные группы в соответствие с представленной ниже схемой (рис. 6).
|
| Рисунок 6. Схема эксперимента ГКД. Серым отмечены гипоксические условия с газовым составом 5% СО2, 1% О2, 94% N2. NBM - Neurobasal Medium, ИЦСЖ - искусственная цереброспинальная жидкость, исследуемые вещества - салицил-карнозин, салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота или карнозин в концентрации 0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ. |
Контрольную группу составила культура клеток, которая не подвергалась ГКД:
1. Культура клеток, которую после замены среды на ИЦСЖ инкубировали в условиях нормоксии в течение 4 часов при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО2 5% с последующей заменой среды на NBM без антиоксидантов.
Экспериментальные группы составили культуры клеток, которые подвергались ГКД:
1. Культура клеток, которую после замены среды на ИЦСЖ без глюкозы инкубировали в условиях гипоксии (5% СО2, 1% О2, 94% N2) в течение 4 часов с последующей реоксигенацией (1 час, 6 часов или 24 часа) и заменой среды на NBM без антиоксидантов;
2. Культура клеток, которую после замены среды на ИЦСЖ без глюкозы с исследуемыми веществами (0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ салицил-карнозин, салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота или карнозин) инкубировали в условиях гипоксии (5% СО2, 1% О2, 94% N2) в течение 4 часов, с последующей реоксигенацией (1 час, 6 часов или 24 часа) и заменой среды на NBM без антиоксидантов, содержащую исследуемые вещества (0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ салицил-карнозин, салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота или карнозин);
3. Культура клеток, которую после замены среды на ИЦСЖ без глюкозы инкубировали в условиях гипоксии (5% СО2, 1% О2, 94% N2) в течение 4 часов, с последующей реоксигенацией (1 час, 6 часов или 24 часа) и заменой среды на NBM без антиоксидантов, содержащую исследуемые вещества (0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ салицил-карнозин, салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота или карнозин).
|
|
|
5. 3. Моделирование NMDA-индуцированной эксайтотоксичности
Для моделирования NMDA-индуцированной эксайтотоксичности первичную культуру клеток коры больших полушарий головного мозга 18-дневных эмбрионов крыс инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО2 5% со 100 мкМ агонистом глутаматных NMDA-рецепторов N-метил-D-аспартатом (NMDA), растворенным в ИЦСЖ без ионов магния, так как ионы магния закрывают ионный канал глутаматных NMDA-рецепторов (Wan Ko et al., 1998). Далее в культуре меняли среду на NBM, содержащую исследуемые вещества в концентрации 0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ (салицил-карнозин, ацетилсалициловую кислоту или карнозин).
Культуры клеток, содержащиеся в 96-луночных планшетах, были разделены на контрольные и экспериментальные группы в соответствие с представленной ниже схемой (рис. 7).
|
| Рисунок 7. Схема моделирования NMDA-индуцированной эксайтотоксичности. NBM - Neurobasal Medium, ИЦСЖ - искусственная цереброспинальная жидкость, NMDA - N-метил-D-аспартат, МК-801 - ингибитор NMDA-рецепторов, исследуемые вещества - салицил-карнозин, ацетилсалициловая кислота или карнозин в концентрации 0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ. |
Культуры клеток разделили на следующие группы:
1. Интактную культуру клеток во время эксперимента содержали в NBM без антиоксидантов при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО2 5%;
2. Культура клеток, которую после замены среды на ИЦСЖ инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО2 5% с последующей заменой среды на NBM без антиоксидантов;
3. Культура клеток, которую после замены среды на ИЦСЖ, содержащую 100 мкМ NMDA и не содержащую ионы магния, инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО2 5%, с последующей заменой среды на NBM без антиоксидантов;
4. Культура клеток, которую после замены среды на ИЦСЖ, содержащую 100 мкМ NMDA и не содержащую ионы магния и кальция, инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО2 5%, с последующей заменой среды на NBM без антиоксидантов;
|
|
|
5. Культура клеток, которую после замены среды на ИЦСЖ, содержащую 50 мкМ антагонист глутаматных NMDA-рецепторов МК-801, 100 мкМ NMDA и не содержащую ионы магния, инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО2 5%, с последующей заменой среды на NBM без антиоксидантов;
6. Культура клеток, которую после замены среды на ИЦСЖ, содержащую 100 мкМ NMDA и не содержащую ионы магния, инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО2 5%, с последующей заменой среды на NBM без антиоксидантов, содержащую 0, 2 мМ, 0, 5 мМ или 1 мМ салицил-карнозин, ацетилсалициловую кислоту или карнозин.
|
|
|
