5.4. Анализ жизнеспособности (МТТ-тест)

5. 4. Анализ жизнеспособности (МТТ-тест)

Живые клетки способны восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5-дифенил-тетразолиум бромид (МТТ) до пурпурного формазана, оптическую плотность которого можно измерить.
Таким образом, можно определить количество живых клеток, проинкубировав их с МТТ.
МТТ растворяли в растворе Хэнкса. Из лунок 96-луночных планшетов отбирали среду и добавляли раствор 0, 5 мг/мл МТТ и инкубировали в течение двух часов при температуре 37°С, относительной влажности 80% и содержании СО₂ 5%. После инкубации полностью отбирали жидкое содержимое лунок. Далее добавляли по 100 мкл ДМСО в лунки для растворения формазана, перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 570 нм (максимум поглощения формазана, Scudiero et al., 1988) и 660 нм (фон) на планшетном ридере Synergy H1 (BioTek). Из значений, полученных при 570 нм, вычитали значения, полученные при 660 нм. Результаты представляли в виде процентов относительно разницы оптической плотности при 570 нм и при 660 нм в лунках с контрольными клетками, инкубированными в ИЦСЖ.

5. 5. Анализ гибели клеток

Гибель клеток оценивали по активности лактатдегидрогеназы. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) - фермент, катализирующий реакцию взаимного превращения пирувата и лактата. При повреждении клетки выделяют ЛДГ (Farhana, Lappin, 2020). Таким образом, высокая активность ЛДГ в среде указывает на высокий уровень повреждения клеток. Активность ЛДГ измеряли в соответствии с протоколом Lactate Dehydrogenase Activity Assay Kit («Sigma-Aldrich», https: //www. sigmaaldrich. com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/1/mak066bul. pdf). В качестве калибровки использовали пробы, содержащие НАДН стандарт, растворенный в LDH Assay Buffer в количестве 0, 2, 5, 5, 7, 5, 10 и 12, 5 нмоль в лунке. Результаты представляли в виде процентов относительно уровня активности ЛДГ в среде с контрольными клетками, инкубированными в ИЦСЖ.

5. 6. Вестерн-блоттинг

Первичную культуру нейронов коры головного мозга 18-дневных эмбрионов крыс линии Вистар дважды промывали в холодном растворе Хэнкса, не содержащем Ca²⁺ и Mg²⁺, лизировали в RIPA буфере («Sigma, США»), содержащем коктейли ингибиторов протеаз и фосфатаз («Sigma, США») на льду. Лизат центрифугировали при 12000 g при 4℃ в течение 10 минут, затем отбирали супернатант. Концентрацию белка в супернатанте измеряли с помощью набора реактивов DC Protein Assay Kit, Bio-Rad, методом Лоури согласно протоколу производителя (https: //www. bio-rad. com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6837. pdf), в качестве калибровки использовали пробы, содержащие RIPA буфер и бычий сывороточный альбумин в концентрациях 0, 0, 3, 0, 6, 0, 9, 1, 2 и 1, 5 мг/мл.

Далее к супернатанту добавляли буфер для образцов (0, 25 М трис-HCl, рН 6, 8, 40% сахароза, 8% SDS, бромфеноловый синий, 4% β -меркаптоэтанол), перемешивали и инкубировали 5 минут при температуре 95°С. Белки разделяли при помощи электрофореза в 12-13% полиакриламидном геле при 200 В в электрофоретической камере для вертикального фореза («BioRad», США), переносили на заранее подготовленную в 70% этаноле PVDF-мембрану («Thermo Scientific», США) при помощи камеры для переноса («BioRad», США) в буфере для переноса (0, 025 М трис, 0, 192 М глицин, 10% этанол) при 100 В в течение 1, 5 часов. Затем мембраны инкубировали 15 минут в растворе, содержащем 7% уксусную кислоту и 10% этанол, после этого отмывали 4 раза по 5 минут в бидистиллированной воде, инкубировали мембраны в реагенте SYPRO Ruby blot stain («Sigma», США) в течение 15 минут для окрашивания на общий белок, далее отмывали 2 раза по 1 минуте в бидистиллированной воде. Мембраны держали на воздухе до полного высыхания и детектировали люминесценцию белков при помощи системы гель-документирования ChemiDoc XRS+ («Bio-Rad»). Затем мембраны блокировали в 5% обезжиренном молоке в буфере TBST (50 мМ трис-HCl, рН 7, 6, 150 мМ NaCl, 0, 1% Tween-20) и проводили инкубацию с первичными антителами, растворенными в 5% БСА на TBST с 1% азидом натрия, в течение 1 часа на качалке при комнатной температуре и промывали 5 раз по 5 минут в TBST. Затем мембраны инкубировали с вторичными антителами, растворенными в 5% обезжиренном молоке на TBST и промывали 5 раз по 5 минут в TBST. Использовали первичные антитела к Bak, Bcl-2, Bcl-xL, Akt, p-Akt, ERK1/2, p-ERK1/2, JNK, p-JNK, pРКС и Nrf2 («Santa Cruz Biotechnology», США (SCBT); «Cell Signalling Technology», США (CST); «DSHB», США; «Millipore», США; «Thermo Scientific», США), а также вторичные антитела anti-goat, anti-rabbit и anti-mouse, конъюгированные с пероксидазой хрена (SCBT, CTS). Мембраны проявляли при помощи хемилюминесцентного субстрата Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate. Люминесценцию полос детектировали при помощи системы гель-документирования ChemiDoc XRS+ («Bio-Rad»), интенсивность обсчитывали при помощи программы Image Lab 3. 0 («Bio-Rad»). Количество белков Nrf2, pPKC и белков семейства Bcl-2 оценивали по отношению интенсивности люминесценции полос исследуемого белка к интенсивности люминесценции при окрашивании на общий белок в соответствующих дорожках на мембране. Активацию киназ Akt, ERK1/2, JNK оценивали по уровню фосфорилирования, то есть по отношению интенсивности люминесценции полос фосфорилированной формы киназы к интенсивности люминесценции полос общего количества киназы, нормированных на общее количество белка в соответствующих дорожках на мембране, а также количество фосфорилированной формы и общее количество киназы оценивались отдельно.