3.6. Экспериментальные модели ишемического инсульта in vitro и in vivo

3. 6. Экспериментальные модели ишемического инсульта in vitro и in vivo

Для моделирования ишемического инсульта in vitro используют два типа моделей - помещение клеточной культуры в условия депривации глюкозы и кислорода или химическое ингибирование электрон-транспортной цепи митохондрий (Holloway, Gavins, 2016).

 Ишемия, индуцированная химическими агентами, может быть вызвана добавлением к культуре клеток раствора, содержащего 0, 5 мМ 2-D-дезоксиглюкозу и различные концентрации азида натрия. В этой модели синтез АТФ в митохондриях блокируется азидом натрия, а выработка АТФ при гликолизе затрудняется из-за удаления глюкозы из внеклеточной среды и предотвращением метаболизма внутриклеточной глюкозы с помощью неметаболизирующейся 2-D-дезоксиглюкозы (He et al., 2013).

Апоптоз клеток вследствие повреждения митохондрий можно вызвать с помощью 0, 75 мкМ ротенона, специфического ингибитора комплекса I ЭТЦ митохондрий (Hong et al., 2014). Эта модель окислительного стресса, нарушения работы митохондрий и кальциевого гомеостаза и воспаления при неврологических заболеваниях используется как для моделирования ишемического инсульта, так и болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера. Ротенон в концентрации 5 мкМ вызывает гибель культуры нейронов мозжечка при инкубации с ним в течение 1 часа (Isaev et al., 2004). Однако in vivo в мозге крыс в концентрации 0, 01 мг/кг ротенон снижал вызванное ишемией повреждение (Rekuviene et al., 2017).

Другой способ моделирования ишемических условий in vitro - помещение культуры клеток в условия глюкозо-кислородной депривации (ГКД), так как при остановке кровоснабжения нейроны больше всего страдают от недостатка именно этих веществ. Следует выбирать такую длительность ГКД, чтобы погибало 40-50% нейронов, так как если погибнет большее число нейронов, то изучаемые эффекты нейропротекторов будет сложно зарегистрировать (Ryou et al., 2018). Чаще всего в литературе встречается 4 (Liu et al., 2019; Shao et al., 2021) и 6 ч (Xiong et al., 2014; Ye et al., 2019) длительность ГКД. При инкубации первичной культуры нейронов коры больших полушарий мышей в среде, содержащей 2 мМ глюкозу, половина нейронов погибает в течение 4-8 часов (Goldberg, Choi, 1993). В условиях ГКД деградация нейронов происходит в течение нескольких часов даже при возвращении культуры в нормальные условия. На первичной культуре нейронов коры больших полушарий мышей 1 ч ГКД приводит к увеличению внеклеточной концентрации глутамата, что соответствует эксайтотоксичности при инсульте (Goldberg, Choi, 1993). Через 6 часов после начала реперфузии в нейронах заметны отличия уровня про- и антиапоптотичесикх белков (Bcl-2, Bax) относительно неподвергавшейся ГКД культуры, а уровень фосфорилирования ERK1/2 изменялся в течение 1 часа (Zakharova et al., 2019).

Также сообщается о возможности изучать механизмы ишемического инсульта с помощью моделирования эксайтотоксичности с применением агонистов глутаматных ионотропных NMDA-рецепторов (Holloway, Gavins, 2016). Активация именно этих ионотропных рецепторов глутамата обусловлена тем, что антагонисты только этих рецепторов снижают гибель нейронов, вызванную эксайтотоксичностью, в то время как антагонисты АМРА и каинатных рецепторов не оказывают нейропротекторного действия (Goldberg, Choi, 1993).

Моделирование ишемии головного мозга in vivo чаще всего проводится на крысах, так как анатомия сосудов головного мозга крыс и их физиология сходны с человеческими (Yamori et al., 1976, Arkelius et al., 2020), а также эксперименты легко воспроизводимы. Наиболее часто встречающаяся в литературе модель ишемического инсульта на животных - это окклюзия среднемозговой артерии (МСАО). МСАО наиболее точно моделирует ишемическое состояние с хорошо воспроизводимыми результатами (Kleinschnitz et al., 2015).

3. 7. Терапевтические мишени при ишемическом инсульте

Единственным эффективным применяющимся в клинической практике препаратом при остром ишемическом инсульте является тканевой активатор плазминогена (Minnerup et al., 2012), однако лишь небольшая часть пациентов получает такое лечение из-за ограниченного терапевтического окна (Chang et al., 2017). Таким образом, актуален поиск альтернативных лекарственных препаратов.

В литературе предложены различные терапевтические мишени, исследованные как в экспериментах на клетках, так и на животных. Одним из способов снизить последствия ишемического инсульта является блокирование механизма глутаматной эксайтотоксичности. Для этого наиболее перспективной мишенью являются NMDA-рецепторы. Однако, их инактивация должна быть основана на подтипах этих рецепторов, так как NR2А-субъединица вызывает эксайтотоксичность только если у нее есть функциональный С-конценвой домен, а при его делеции токсичность обусловлена только NR2В, что показано на первичной культуре коры головного мозга мышей (Von Engelhardt et al., 2007). Таким образом, антагонист субъединицы NR2B не должен блокировать кальциевый ток через рецепторы, содержащие NR2A-субъединицы, для поддержания их физиологической функции. Авторы этой работы заключают, что применение таких веществ в клинической практике маловероятно.

При эксайтотоксичности антиапоптотический белок Bcl-xL расщепляется каспазами до Δ N-Bcl-xL, формы, которая способствует гибели нейронов. Она предлагается в качестве терапевтической мишени, так как ее ингибирование способствует выживанию первичной культуры нейронов (Park, Jonas, 2017).

Также в литературе предложен ряд других терапевтических мишеней. Например, фармакологический активатор АМРК акадезин усиливает активность АМРК и способствует таким образом выживанию нейронов в условиях ГКД (Jiang et al., 2018). Некодирующие РНК, также принимающие участие в регуляции процессов, происходящих при ишемическом инсульте, предлагаются в качестве потенциальных терапевтических мишеней (Wang et al., 2018).

Ряд работ посвящен исследованию влияния блокаторов молекул, участвующих в воспалении при ишемическом инсульте. ММР участвуют в нарушении ГЭБ, но также играют важную роль в восстановлении и ангиогенезе, поэтому ингибиторы ММР могут быть использованы только в том случае, если их действие будет ограничено по времени. Ингибитор ММР-9 миноциклин предлагается в качестве комбинированной терапии с тканевым активатором плазминогена, так как тканевой активатор плазминогена увеличивает кровоизлияние в мозг при введении после 6 часов у крыс, в то время как совместно с миноциклином, снижающим уровень ММР-9 в плазме, он уменьшал инфаркт у крыс и кровоизлияние в мозг (Murata et al., 2008).

Подавление иммунного ответа также исследуется в качестве терапевтической мишени. Антагонист рецептора интерлейкина-1 при введении его во время реперфузии защищает от ишемического повреждения in vivo (Pradillo et al., 2012). TNFα не является подходящей терапевтической мишенью, так как в литературе есть данные, как показывающие его нейропротекторное действие при его профилактическом введении мышам (Nawashiro et al., 1997b), так и уменьшение зоны инфаркта при блокировании действия TNFα (Nawashiro et al., 1997a).

Другой перспективной терапевтической мишенью являются митохондрии. Именно это клеточные органеллы являются основными источниками АФК, их повреждение приводит к истощению энергии в клетке и активации каспаза-зависимого апоптоза. Доклинические исследования показывают эффективность использования стволовых клеток, которые транспортируют митохондрии в поврежденные клетки через TNTs, внеклеточные везикулы или в результате слияния клеток (Sarmah et al., 2018). Для борьбы с АФК, генерируемых митохондриями, потенциальным нейропротектором является ресвератрол, который активирует антиоксидантную систему клетки с помощью активации астроцитарного Nrf-2 (Narayanan et al., 2015).

Карнозин является природным дипептидом (β -Ala-L-His), который обладает антиоксидантным и нейропротекторным действием. Он способствует активации транскрипционного фактора CREB, который приводит к экспрессии антиапоптотических белков (Fujii et al., 2017). Многочисленные доклинические исследования показали его эффективность при моделировании фокальной ишемии на животных (Rajanikant et al., 2007; Pekcetin et al., 2009; Zhang et al., 2014). Однако, в крови человека карнозин легко расщепляется ферментом карнозиназой (Everaert et al., 2012), что делает невозможным его применение в клинике.

Для профилактики повторного инсульта используют такие антиагрегантные препараты, как аспирин, клопидогрель и дипиридамол. Однако, эти препараты нарушают физиологический гемостаз (Florescu et al., 2019). Аспирин (ацетилсалициловая кислота), самый часто используемый из них, блокирует действие проапоптотических JNK и NF-κ B, активированных вследствие поступления в нейроны кальция через NMDA-рецепторы (Wan Ko et al., 1998). Также аспирин ингибирует продолжительную активацию ЕРК1/2, снижая повреждение в модели ишемии/реперфузии (Vartiainen et al., 2013). В то же время, аспирин, как и другие НПВП, имеет побочные эффекты со стороны ЖКТ, например, при применении аспирина возникают диспепсия, желудочно-кишечные кровотечения (Haastrup, Jarbø l, 2014).

Таким образом, антиоксиданты являются перспективными препаратами для уменьшения последствий ишемического инсульта, однако эффективный нейропротектор до сих пор не найден.