 |
1. Идентификация возбудителя. 1.1 Выделение вируса. 1.2. Иммунологические методы. 1.2.1. Иммуноферментный анализ (ИФА)
|
|
|
|
1. Идентификация возбудителя
С помощью процедуры выделения вируса или полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией можно исследовать различные типы образцов, включая эпителий, образцы пищеводно-глоточной жидкости, молоко и сыворотки крови. Напротив, ИФА, реакция связывания комплемента и устройство с боковым потоком подходят для исследования эпителиальных суспензий, везикулярной жидкости или супернатантов культуры клеток, но они недостаточно чувствительны для прямого исследования образцов пищеводно-глоточной жидкости или сыворотки крови.
1. 1 Выделение вируса
Эпителиальные образцы следует извлечь из забуференного фосфатом солевого раствора/глицерина, высушить, нанеся на фильтровальную бумагу для уменьшения содержания глицерина, токсичного для клеточных культур, и взвесить. Необходимо приготовить суспензию, размельчив образец в стерильном песке при помощи стерильного пестика и в стерильной ступке с небольшим количеством среды для культивирования тканей и антибиотиков. Затем следует еще добавлять среду до тех пор, пока итоговый объем не будет в 9 раз превышать объем образца эпителия, получив 10% суспензию. Данную суспензию центрифугируют в настольной центрифуге при 2000 g в течение 10 минут. После центрифугирования такие суспензии полевых образцов, в отношении которых существуют подозрения, что они содержат вирус ящура, инокулируют на культуры клеток. Чувствительные культуры клеток включают первичные клетки бычьей (телячьей) щитовидной железы и первичные клетки почек свиней, телят и ягнят. Также можно использовать стабильные клеточные линии, такие как клетки ВНК-21 (почки новорожденного хомяка) и IB-RS-2, но они обычно менее чувствительны, чем первичные клетки для обнаружения низких уровней инфекционности. Чувствительность любых используемых клеток должна быть протестирована с использованием стандартных препаратов вируса ящура. Использование IB-RS-2 помогает дифференцировать вирус везикулярной болезни свиней (SVDV) и вирус ящура (так как вирус везикулярной болезни свиней растет только в клетках свиного происхождения) и часто необходимо для выделения свиных штаммов, таких как O Cathay. Культуры клеток необходимо исследовать на наличие цитопатогенного действия (ЦПД) в течение 48 часов. Если ЦПД не выявлено, клетки следует заморозить и оттаять, инокулировать в свежие культуры и исследовать еще раз на наличие ЦПД в течение других 48 часов. Если это пищеводно-глоточные жидкости, предварительная обработка пищеводно-глоточной жидкости равным количеством хлорфторуглеродами, повышает вероятность обнаружения вируса, путем высвобождения вируса из иммунных комплексов.
|
|
|
1. 2. Иммунологические методы
1. 2. 1. Иммуноферментный анализ (ИФА)
Иммуноферментный анализ является предпочтительным методом для обнаружения антигена вируса ящура и идентификации вирусного серотипа (Ferris & Donaldson, 1992; Roedеr & Le Blanc Smith, 1987). Это - непрямой сэндвич-тест, при проведении которого различные ряды в многолуночных планшетах сенсибилизируют кроличьими антисыворотками к каждому из семи серотипов вируса ящура. Они представляют собой сыворотки крови «для захвата». Тестируемые образцы суспензии добавляют в каждый ряд, а также включают соответствующие контроли. Затем добавляют антисыворотки морских свинок к каждому из серотипов вируса ящура, после чего добавляют кроличью сыворотку против глобулинов морской свинки, конъюгированную с ферментом. После каждой стадии производят экстенсивное промывание, для удаления несвязанных реагентов. Цветная реакция при добавлении субстрата фермента и хромогена указывает на положительную реакцию. При интенсивных положительных реакциях это будет видно невооруженным глазом, однако можно также произвести спектрофотометрическое считывание результатов при соответствующей длине волны. В этом случае, показатель оптической плотности выше фонового, чем 0. 1, указывает на наличие положительной реакции; также можно идентифицировать серотип вируса ящура. Значения, близкие к 0. 1 следует подтверждать при помощи повторного тестирования или амплификации антигена с помощью пассирования культуры ткани и тестирования супернатанта после развития ЦПД. Подходящая процедура исследования приведена ниже. Имеются другие процедуры с несколько отличными форматами и критериями интерпретации (Alonso et al., 1993).
|
|
|
В зависимости от пораженных видов животных и географического происхождения образцов, возможно, целесообразно проводить параллельное тестирование на наличие вируса везикулярной болезни свиней (SVDV) или вируса везикулярного стоматита (VSV). В идеале, полную дифференциальную диагностику следует проводить при всех везикулярных состояний.
Кроличья антисыворотка к 146S антигену каждого из семи серотипов вируса ящура (и, если необходимо, вируса SVD или вируса VSV) используется в качестве захватывающего антитела в заранее определенной оптимальной концентрации в карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9, 6.
Контрольные антигены получают из отобранных штаммов каждого из семи серотипов вируса ящура (плюс, в случае необходимости, вируса SVD или вируса VSV), выращенных в монослойных культурах ВНК-21 клеток (IB-RS-2 клеток для SVDV или VSV). Используют неочищенные супернатанты и проводят их предварительное титрование на ИФА планшетах. Выбранное конечное разведение представляет собой разведение, которое дает абсорбцию в наивысшей точке линейной области титрационной кривой (оптическая плотность приблизительно 2. 0), таким образом, чтобы пятикратные разведения контрольных антигенов, использованных в тесте, давали два дополнительных более низких показателя оптической плотности при считывании, которые можно использовать для получения титрационной кривой.. Забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР), содержащий 0, 05% Твин 20 феноловый красный индикатор, используют в качестве разбавителя (PBST).
|
|
|
Антисыворотка морской свинки, полученная путем прививки морских свинок 146S антигеном одного из семи серотипов вируса ящура (плюс, если необходимо, вируса SVD или вируса VSV) и предварительно блокированная нормальной бычьей сывороткой (NBS), используется для выявления антител. Предварительно определенные оптимальные концентрации получают в ЗФР, содержащем 0, 05% Твин 20 и 5% сухое обезжиренное молоко (PBSTM).
Кроличий (или овечий) иммуноглобулин против глобулинов морской свинки, конъюгированный с пероксидазой хрена и предварительно блокированный нормальной бычьей сывороткой (NBS), используется в заранее установленной оптимальной концентрации в PBSTM. В качестве альтернативы кроличьей антисыворотки и антисыворотки морской свинки, можно использовать подходящие моноклональные антитела (Mabs), которые используют для сенсибилизации планшетов для ИФА, в качестве захватывающего антитела или используют в конъюгированном с пероксидазой виде в качестве детекционного антитела. Имеется валидированный готовый к использованию набор на основе предварительно отобранных моноклональных антител для обнаружения и серотипирования шести из семи серотипов вируса ящура.
|
|
|
